فحص نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية
Summary
هنا نصف مقايسة نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية في المنزل. تم استخدام المقايسات القائمة على النشاط والمقايسات القائمة على المستضد لقياس عامل الأنسجة في الحويصلات خارج الخلية من عينات البلازما البشرية. المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد.
Abstract
عامل الأنسجة (TF) هو مستقبل عبر الغشاء للعامل (F) VII و FVIIa. يبدأ مجمع TF / FVIIa سلسلة التخثر عن طريق تنشيط كل من FIX و FX. يتم إطلاق TF من الخلايا إلى الدورة الدموية في شكل حويصلات خارج الخلية (EVs). يزداد مستوى EVs الإيجابية (+) في أمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والالتهابات البكتيرية والفيروسية وتليف الكبد ، ويرتبط بالتخثر والتخثر المنتشر داخل الأوعية وشدة المرض والوفيات. هناك طريقتان لقياس TF + EVs في البلازما: المقايسات القائمة على المستضد والنشاط. تشير البيانات إلى أن المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد. تصف هذه الورقة مقايسة نشاط EVTF الداخلية الخاصة بنا بناء على فحص جيل FXa على مرحلتين. تتم إضافة FVIIa و FX والكالسيوم إلى العينات المحتوية على TF + EV لتوليد FXa في وجود وغياب الأجسام المضادة المضادة ل TF لتمييز جيل FXa المعتمد على TF عن جيل FXa المستقل عن TF. يتم استخدام ركيزة كروموجينية مشقوقة بواسطة FXa لتحديد مستوى FXa ، بينما يتم استخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام TF المؤتلف المعاد تدبيره لتحديد تركيز TF. يتميز اختبار نشاط EVTF الداخلي هذا بحساسية وخصوصية أعلى من مقايسة نشاط TF التجاري.
Introduction
يبدأ تخثر الدم بربط العامل (F) VII / VIIa بعامل الأنسجة (TF) 1. ينشط مركب TF / FVIIa كلا من FIX و FX لتنشيط تخثر الدم1. هناك نوعان من TF كامل الطول المرتبط بالغشاء: مشفر ونشط. بالإضافة إلى ذلك ، هناك شكل مقسم بدلا من TF (asTF). يحافظ Sphingomyelin و phosphatidylcholine في النشرة الخارجية لغشاء الخلية على TF في حالة مشفرة2،3،4. عندما يتم تنشيط الخلايا أو تلفها ، ينقل الفوسفوليبيد سكرامبلاز الفوسفاتيديل سيرين وغيره من الدهون الفوسفاتية سالبة الشحنة إلى النشرة الخارجية1. يؤدي تنشيط الخلايا أيضا إلى نقل حمض السفينغوميليناز إلى النشرة الخارجية حيث يتحلل السفينغوميلين إلى سيراميد5. تقوم هاتان الآليتان بتحويل TF المشفر إلى النموذج النشط. يقترح أيضا أن إيزوميراز ثاني كبريتيد البروتين يتوسط تكوين رابطة ثاني كبريتيد بين Cys186 و Cys209 في TF المشفر ، مما يؤدي إلى فك تشفير TF6،7،8. asTF موجود أيضا في الدورة الدموية ولكنه يفتقر إلى المجال عبر الغشاء وبالتالي فهو قابل للذوبان 9,10. الأهم من ذلك ، أن asTF لديها مستويات منخفضة جدا من نشاط التخثر مقارنة ب TF10,11 النشط كامل الطول.
يتم إطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs) من الخلايا المضيفة التي تستريح وتنشط وتموت ، وكذلك الخلايا السرطانية12. تعبر المركبات الكهربائية عن البروتينات من خلاياها الأبوية12. يتم إطلاق EVs النشطة الحاملة ل TF من الخلايا الوحيدة المنشطة والخلايا البطانية والخلايا السرطانية في الدورة الدموية13،14،15. يمكن قياس مستويات TF في البلازما عن طريق المقايسات القائمة على النشاط والمستضد. تشمل المقايسات القائمة على المستضد ELISA وقياس التدفقالخلوي 16. هناك نوعان مختلفان من المقايسات القائمة على النشاط: مقايسات نشاط TF على مرحلتين ومرحلتين. يعتمد الفحص أحادي المرحلة على مقايسة التخثر القائمة على البلازما. تضاف العينة المحتوية على TF إلى البلازما ويتم قياس وقت تكوين الجلطة بعد إعادة التكلس. يقيس الفحص المكون من مرحلتين جيل FXa من العينات عن طريق إضافة FVII أو FVIIa و FX والكالسيوم. يتم تحديد مستويات FXa باستخدام ركيزة مشقوقة بواسطة FXa.
في كل من مقايسات نشاط TF ذات المرحلة الواحدة والمرحلتين ، يتم تحديد تركيز TF باستخدام منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام TF المؤتلف. تتمتع المقايسات ذات المرحلتين بحساسية وخصوصية أعلى من الفحص أحادي المرحلة. أكدت العديد من الدراسات أن المقايسات القائمة على النشاط لها حساسية وخصوصية أعلى من المقايسات القائمة على المستضد17،18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقايسة النشاط الداخلي لدينا لها حساسية وخصوصية أعلى من مقايسة النشاط التجاري22. الأفراد الأصحاء لديهم مستويات منخفضة جدا أو لا يمكن اكتشافها من نشاط EVTF في البلازما. في المقابل ، فإن الأفراد الذين يعانون من حالات مرضية ، مثل السرطان وتليف الكبد والإنتان والعدوى الفيروسية ، لديهم مستويات يمكن اكتشافها من نشاط EVTF وهذا يرتبط بالتخثر ، والتخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية ، وشدة المرض ، والوفيات23،24،25،26،27،28. هنا ، سنصف اختبار نشاط EVTF الداخلي المكون من مرحلتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم تقديم بروتوكول فحص نشاط EVTF الداخلي الخاص بنا. هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول. عند إعادة تكوين حبيبات EV, من المهم أن تكون ماصة لأعلى ولأسفل في موقع حبيبات EV حتى لو لم تكن مرئية. ستؤدي إعادة التكوين غير الكاملة لحبيبات EV إلى سلبية خاطئة أو تقليل تقدير قيم نشاط EVTF للعينات. ثانيا ، …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NHLBI R35HL155657 (NM) وأستاذ جون سي باركر (NM). نود أن نشكر السيدة سييرا ج. أرشيبالد على تعليقاتها المفيدة
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor – one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
