Анализ активности факторов внеклеточной везикулярной ткани
Summary
Здесь мы опишем собственный анализ активности фактора внеклеточной везикулярной ткани. Анализы, основанные на активности, и анализы на основе антигенов были использованы для измерения тканевого фактора во внеклеточных везикулах из образцов плазмы крови человека. Анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов.
Abstract
Тканевый фактор (ТФ) является трансмембранным рецептором для факторов (F) VII и FVIIa. Комплекс TF/FVIIa инициирует коагуляционный каскад, активируя как FIX, так и FX. ТФ высвобождается из клеток в кровоток в виде внеклеточных везикул (ВВ). Уровень ТФ-положительных (+) ВВ повышен при различных заболеваниях, включая онкологические, бактериальные и вирусные инфекции, цирроз печени, и связан с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и летальностью. Существует два способа измерения ТФ+ ВВ в плазме: анализ на основе антигена и анализ на основе активности. Данные свидетельствуют о том, что анализы, основанные на активности, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализы на основе антигенов. В этом документе описывается наш собственный анализ активности EVTF, основанный на двухступенчатом анализе генерации FXa. FVIIa, FX и кальций добавляют к образцам, содержащим ТФ+ EV, для генерации FXa в присутствии и отсутствии антител к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Для определения уровня FXa используется хромогенный субстрат, расщепленный FXa, в то время как стандартная кривая, сгенерированная с помощью релипированного рекомбинантного TF, используется для определения концентрации TF. Этот собственный анализ активности ЭВТФ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем коммерческий анализ активности ТФ.
Introduction
Свертывание крови начинается со связывания фактора (F) VII/VIIa с тканевым фактором (TF)1. Комплекс TF/FVIIa активирует как FIX, так и FX для активации свертывания крови1. Существует две формы полноразмерного мембранного ТФ: зашифрованный и активный. Кроме того, существует альтернативно сплайсированная форма ТФ (asTF). Сфингомиелин и фосфатидилхолин в наружной створке клеточной мембраны поддерживают ТФ в зашифрованном состоянии 2,3,4. Когда клетки активируются или повреждаются, фосфолипидная скрамблаза переносит фосфатидилсерин и другие отрицательно заряженные фосфолипиды на внешнюю створку1. Активация клеток также приводит к транслокации кислой сфингомиелиназы на внешнюю створку, где она разлагает сфингомиелин до церамида5. Эти два механизма преобразуют зашифрованный TF в активную форму. Также предполагается, что белковая дисульфидизомераза опосредует образование дисульфидных связей между Cys186 и Cys209 в зашифрованном ТФ, что приводит к расшифровке ТФ 6,7,8. asTF также присутствует в кровотоке, но у него отсутствует трансмембранный домен, и поэтому он растворим 9,10. Важно отметить, что asTF имеет очень низкий уровень прокоагулянтной активности по сравнению с полноразмерным активным TF10,11.
Внеклеточные везикулы (ВВ) высвобождаются из покоящихся, активированных и умирающих клеток хозяина, а также из раковых клеток12. ВВ экспрессируют белки из родительских клеток12. Активные ТФ-содержащие ВВ высвобождаются из активированных моноцитов, эндотелиальных клеток и опухолевых клеток в кровоток 13,14,15. Уровни ТФ в плазме могут быть измерены с помощью анализов активности и антигенов. Анализы на основе антигенов включают ИФА и проточную цитометрию16. Существует два различных анализа активности: одноэтапный и двухэтапный анализ активности ТФ. Одноэтапный анализ основан на анализе свертывания крови на основе плазмы. Образец, содержащий ТФ, добавляют в плазму и измеряют время образования сгустка после повторной кальцификации. Двухступенчатый анализ измеряет генерацию образцов FXa путем добавления FVII или FVIIa, FX и кальция. Уровни FXa определяются с помощью субстрата, который расщепляется FXa.
Как в одностадийном, так и в двухступенчатом анализе активности ТФ концентрация ТФ определяется с помощью стандартной кривой, полученной с помощью рекомбинантного ТФ. Двухэтапные анализы обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем одностадийные. Многие исследования подтвердили, что анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов 17,18,19,20,21. Кроме того, наш собственный анализ активности имеет более высокую чувствительность и специфичность, чем анализ коммерческой деятельности22. Здоровые люди имеют очень низкие или неопределяемые уровни активности ЭВТФ в плазме. Напротив, лица с патологическими состояниями, такими как рак, цирроз печени, сепсис и вирусная инфекция, имеют обнаруживаемые уровни активности ЭВТФ, и это связано с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и смертностью 23,24,25,26,27,28. В этой статье мы опишем этот собственный двухступенчатый анализ активности EVTF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлен протокол нашего собственного анализа активности ЭВТФ. Протокол состоит из трех важнейших этапов. При восстановлении гранулы EV важно проводить пипеткой вверх и вниз в том месте, где находится гранула EV, даже если она не видна. Неполное восстановление гранулы EV приведе?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана R35HL155657 NIH NHLBI (Нью-Мексико) и профессором Джона С. Паркера (Нью-Мексико). Мы хотели бы поблагодарить г-жу Сьерру Арчибальд за ее полезные комментарии
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor – one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
