Assay zur Aktivität des extrazellulären Vesikelgewebefaktors
Summary
Hier beschreiben wir einen hauseigenen extrazellulären Vesikel-Gewebefaktor-Aktivitätstest. Aktivitätsbasierte Assays und Antigen-basierte Assays wurden verwendet, um den Gewebefaktor in extrazellulären Vesikeln aus humanen Plasmaproben zu messen. Aktivitätsbasierte Assays haben eine höhere Sensitivität und Spezifität als Antigen-basierte Assays.
Abstract
Der Gewebefaktor (TF) ist ein Transmembranrezeptor für Faktor (F) VII und FVIIa. Der TF/FVIIa-Komplex initiiert die Gerinnungskaskade, indem er sowohl FIX als auch FX aktiviert. TF wird in Form von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus den Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Der Spiegel von TF-positiven (+) EVs ist bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, bakteriellen und viralen Infektionen und Zirrhose, erhöht und wird mit Thrombosen, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Schwere der Erkrankung und Mortalität in Verbindung gebracht. Es gibt zwei Möglichkeiten, TF+ EVs im Plasma zu messen: Antigen- und aktivitätsbasierte Assays. Die Daten deuten darauf hin, dass aktivitätsbasierte Assays eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen als antigenbasierte Assays. In diesem Artikel wird unser hauseigener EVTF-Aktivitätsassay beschrieben, der auf einem zweistufigen FXa-Generierungsassay basiert. FVIIa, FX und Kalzium werden zu den TF+ EV-haltigen Proben hinzugefügt, um FXa in Gegenwart und Abwesenheit von Anti-TF-Antikörpern zu erzeugen, um die TF-abhängige FXa-Generation von der TF-unabhängigen FXa-Generation zu unterscheiden. Ein chromogenes Substrat, das von FXa gespalten wird, wird verwendet, um den FXa-Gehalt zu bestimmen, während eine Standardkurve, die mit einem relipidierten rekombinanten TF erzeugt wird, für die Bestimmung der TF-Konzentration verwendet wird. Dieser hauseigene EVTF-Aktivitätsassay hat eine höhere Sensitivität und Spezifität als ein kommerzieller TF-Aktivitätstest.
Introduction
Die Blutgerinnung wird durch die Bindung des Faktors (F) VII/VIIa an den Gewebefaktor (TF)1 eingeleitet. Der TF/FVIIa-Komplex aktiviert sowohl FIX als auch FX, um die Blutgerinnung zu aktivieren1. Es gibt zwei Formen von membrangebundener TF in voller Länge: verschlüsselt und aktiv. Darüber hinaus gibt es eine alternativ gespleißte Form von TF (asTF). Sphingomyelin und Phosphatidylcholin in der äußeren Hülle der Zellmembran halten TF in einem verschlüsselten Zustand 2,3,4. Wenn Zellen aktiviert oder beschädigt werden, überträgt Phospholipid-Scramblase Phosphatidylserin und andere negativ geladene Phospholipide auf die äußere Packung1. Die Aktivierung von Zellen führt auch zur Translokation der sauren Sphingomyelinase in die äußere Hülle, wo sie Sphingomyelin zu Ceramid5 abbaut. Diese beiden Mechanismen wandeln verschlüsselte TF in die aktive Form um. Es wird auch vorgeschlagen, dass die Protein-Disulfid-Isomerase die Disulfidbindungsbildung zwischen Cys186 und Cys209 in verschlüsselter TF vermittelt, was zu einer Entschlüsselung von TF 6,7,8 führt. asTF ist ebenfalls im Blutkreislauf vorhanden, aber es fehlt die Transmembrandomäne und ist daher löslich 9,10. Wichtig ist, dass asTF im Vergleich zu aktivem TF10,11 in voller Länge eine sehr geringe prokoagulanziöse Aktivität aufweist.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von ruhenden, aktivierten und sterbenden Wirtszellen sowie von Krebszellen freigesetzt12. EVs exprimieren Proteine aus ihren Elternzellen12. Aktive TF-tragende EVs werden aus aktivierten Monozyten, Endothelzellen und Tumorzellen in den Blutkreislauf freigesetzt 13,14,15. Der TF-Gehalt im Plasma kann durch aktivitäts- und antigenbasierte Assays gemessen werden. Zu den Antigen-basierten Assays gehören ELISA und Durchflusszytometrie16. Es gibt zwei verschiedene aktivitätsbasierte Assays: einstufige und zweistufige TF-Aktivitätsassays. Der einstufige Assay basiert auf einem plasmabasierten Gerinnungsassay. Die TF-haltige Probe wird dem Plasma zugesetzt und die Zeit bis zur Bildung eines Gerinnsels nach der Rekalzifizierung gemessen. Der zweistufige Assay misst die FXa-Generierung von Proben durch Zugabe von FVII oder FVIIa, FX und Kalzium. FXa-Niveaus werden mit einem Substrat bestimmt, das von FXa gespalten wird.
Sowohl in den ein- als auch in den zweistufigen TF-Aktivitätsassays wird die TF-Konzentration anhand einer Standardkurve bestimmt, die mit rekombinantem TF erstellt wird. Zweistufige Assays haben eine höhere Sensitivität und Spezifität als der einstufige Assay. Viele Studien haben bestätigt, dass aktivitätsbasierte Assays eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweisen als antigenbasierte Assays 17,18,19,20,21. Darüber hinaus weist unser hauseigener Aktivitätsassay eine höhere Sensitivität und Spezifität auf als ein kommerzieller Aktivitätsassay22. Gesunde Personen haben eine sehr niedrige oder nicht nachweisbare EVTF-Aktivität im Plasma. Im Gegensatz dazu weisen Personen mit pathologischen Erkrankungen wie Krebs, Zirrhose, Sepsis und Virusinfektion nachweisbare EVTF-Aktivitäten auf, die mit Thrombosen, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Schwere der Erkrankung und Mortalität verbunden sind 23,24,25,26,27,28. Hier beschreiben wir diesen hauseigenen zweistufigen EVTF-Aktivitätstest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird das Protokoll unseres hauseigenen EVTF-Aktivitätstests vorgestellt. Das Protokoll besteht aus drei kritischen Schritten. Bei der Rekonstitution des EV-Pellets ist es wichtig, an der Stelle des EV-Pellets auf und ab zu pipettieren, auch wenn es nicht sichtbar ist. Eine unvollständige Rekonstitution des EV-Pellets führt zu einem falsch negativen Ergebnis oder zu einer Unterschätzung der EVTF-Aktivitätswerte der Proben. Zweitens ist die Verwendung von HBSA-Ca(+) in Protokollschritt 6.5 von entscheidender Bede…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) und der John C. Parker Professur (N.M.) unterstützt. Wir danken Frau Sierra J. Archibald für ihre hilfreichen Kommentare
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor – one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
