rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達
Summary
我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10 マウスにおけるこれらの細胞の網膜下送達のための詳細なプロトコルについて記述する。
Abstract
ヒト多能性幹細胞を用いた視細胞の再生は、進行期の遺伝性網膜疾患と老化性網膜疾患の両方を治療するための有望な治療法です。ヒト組換え網膜特異的ラミニンアイソフォームマトリックスは、ヒト胚性幹細胞(hESC)の視細胞前駆細胞への分化をサポートできることを示しました。さらに、これらの細胞の網膜下注射も、 rd10 げっ歯類およびウサギモデルで部分的な回復を示しています。網膜下注射は、標的空間に近いため、眼の視細胞および網膜色素上皮(RPE)層に医薬品化合物を送達するために使用されている確立された方法であることが知られています。また、網膜疾患を治療するために、アデノ随伴ウイルスベクターを網膜下腔に送達するためにも使用されています。マウスモデルにおける医薬品化合物および細胞の網膜下送達は、マウス眼球のサイズに制約があるため、困難である。このプロトコルは遺伝の網膜色素変性症の突然変異体、 rd10 マウスのこれらのセルの注入そして網膜の下配達技術のためのhESC得られた光受容体の祖先のセルの準備のための詳しいプロシージャを記述する。このアプローチにより、標的領域、特に視細胞変性につながる疾患が発生する網膜の外側の核層への細胞治療が可能になります。
Introduction
遺伝性の網膜疾患や加齢黄斑変性症は、視細胞の喪失や最終的には失明につながります。網膜光受容体は、光伝達(すなわち、光をニューロン信号に変換すること)に関与する特殊な細胞で構成される網膜の外側セグメント層です。桿体および錐体視細胞は、網膜色素層(RPE)1に隣接しています。細胞の損失を補うための光受容体細胞補充療法は、新しく発展している治療アプローチです。損傷した視細胞を修復するために、胚性幹細胞(ESC)2,3,4、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来RPE細胞、網膜前駆細胞(RPC)4,5,6,7,8を使用しました。網膜下腔、網膜とRPEの間の閉鎖空間は、その近傍のために損傷した視細胞、RPE、およびミューラー細胞を置き換えるためにこれらの細胞を沈着させる魅力的な場所です9,10,11。
遺伝子治療や細胞治療は、前臨床試験において様々な網膜疾患に対する再生医療に網膜下腔を活用しています。これには、抗センスオリゴヌクレオチド療法12,13またはCRISPR/Cas9、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースの戦略14,15,16、材料の移植(RPEシート、網膜補綴物17,18,19)、分化幹細胞由来網膜オルガノイド20のいずれかの形での遺伝子または遺伝子編集ツールの機能コピーの送達が含まれます、21,22網膜およびRPE関連疾患を治療する。RPE65関連レーバー先天性黒内障(LCA)23,24、CNGA3連鎖色覚異常25、MERTK関連網膜色素変性症26、脈絡膜血症27,28,29,30を治療するための網膜下腔におけるhESC-RPE31を用いた臨床試験効果的なアプローチであることが証明されています。損傷部位付近に細胞を直接注入することで、適切な領域への細胞の沈降、シナプス統合、および最終的な視覚的改善の可能性が大幅に向上します。
ヒトおよび大型眼モデル(すなわち、ブタ32,33,34,35、ウサギ36,37,38,39,40、および非ヒト霊長類41,42,43)への網膜下注射が確立されていますが、マウスモデルへのそのような注射は、眼球のサイズと巨大さの制約のために依然として困難ですマウスの目44、45、46を占めるレンズ。しかし、遺伝子改変モデルは小動物でのみ容易に利用でき、大型動物(ウサギやヒト以外の霊長類)では入手できないため、マウスへの網膜下注射は、網膜遺伝性疾患の新しい治療法を検討するために注目を集めています。細胞またはAAVを網膜下腔に送達するために、3つの主要なアプローチ、すなわち経角膜経路、経強膜経路、および扁平部経路が使用されています(図2を参照)。経角膜および経強膜経路は、白内障形成、癒着、脈絡膜出血、および注射部位からの逆流に関連しています11,44,45,47,48,49。射出プロセスを直接可視化するパースプラナアプローチを採用し、顕微鏡下でリアルタイムに射出部位を把握することができます。
我々は最近、組換えヒト網膜特異的ラミニンアイソフォームLN523を用いて、ゼノフリーの化学的に定義された条件下でヒト胚性幹細胞(hESC)を光受容体前駆細胞に分化させる方法を記載した。LN523が網膜に存在することがわかったので、ヒト網膜の細胞外マトリックスニッチが in vitro で再現され、それによってヒトES細胞からの光受容体の分化をサポートできるという仮説を立てました36。シングルセルトランスクリプトーム解析により、コーンロッドホメオボックスとリフェリンを共発現する光受容体前駆細胞が32日後に生成されることが示されました。常染色体ヒト網膜色素変性症を模倣した網膜変性10(rd10)変異マウスモデルを用いて、ヒトES細胞由来光受容体前駆細胞32日目の生体内における有効性を評価し た。ヒトES細胞由来の視細胞前駆細胞を、視受容器の機能不全と変性が進行しているP20の rd10 マウスの網膜下腔に注入した36。ここでは、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と rd10 マウスの網膜下腔への送達に関する詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、AAV、細胞懸濁液、ペプチド、または化学物質をマウスの網膜下腔に投与するためにも使用できます。
Protocol
in vivo実験は、SingHealthの動物管理および使用委員会(IACUC)および眼科および眼科研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って行われました。仔犬は、シクロスポリン(260 g / L)を含む飲料水を与えることにより、P17(移植前)からP30(移植後)までの免疫抑制を行いました。 …
Representative Results
10 μL のガラスシリンジはメーカーの指示に従って組み立て(図 1)、細胞懸濁液/培地の送達に使用した鈍い針を 図 1B に示します。網膜下注射のさまざまなアプローチを 図2に示します。このプロトコルでは、pars planaアプローチについて説明します(図2C)。ガラス注射器に取り付けられた鈍い針は、硬化切?…
Discussion
網膜下注射は、RPEおよび網膜疾患を治療するための細胞懸濁移植に使用されています23,25,26,27,28,31,40。このアプローチは、細胞移植や遺伝子治療のアプローチだけでなく、網膜疾患の新規治療化合物を評価するために?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
凍結保存後32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製に技術支援を提供してくれたWei Sheng Tan氏、Luanne Chiang Xue Yen氏、Xinyi Lee氏、Yingying Chung氏に感謝します。この研究の一部は、National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017)およびNational Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)からH.G.T.への助成金によって支援されました。
Materials
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
Citer Cet Article
Tun, S. B. B., Shepherdson, E., Tay, H. G., Barathi, V. A. Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice. J. Vis. Exp. (200), e65848, doi:10.3791/65848 (2023).