Оценка нейротоксичности у взрослых Danio rerio с использованием батареи поведенческих тестов в одном аквариуме
Summary
Здесь мы представляем комплексную батарею поведенческих тестов, включая новый аквариум, шолинг и тесты социальных предпочтений, для эффективного определения потенциального нейротоксического воздействия химических веществ (например, метамфетамина и глифосата) на взрослых рыбок данио, использующих один аквариум. Этот метод имеет отношение к нейротоксичности и экологическим исследованиям.
Abstract
Наличие невропатологических эффектов в течение многих лет являлось основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества. Однако в последние 50 лет активно исследуется влияние химических веществ на поведение модельных видов. Постепенно поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные результаты в настоящее время регулярно используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио предоставляют стандартизированные и надежные средства для изучения широкого спектра поведения, включая тревогу, социальное взаимодействие, обучение, память и зависимость. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио обычно включают в себя помещение рыб на экспериментальную арену, запись и анализ их поведения с помощью программного обеспечения для видеослежения. Рыбы могут подвергаться воздействию различных стимулов, а их поведение может быть количественно оценено с помощью различных показателей. Новый аквариумный тест является одним из наиболее принятых и широко используемых тестов для изучения тревожного поведения у рыб. Тесты на косяки и социальные предпочтения полезны при изучении социального поведения рыбок данио. Этот анализ особенно интересен, так как изучается поведение всего косяка. Эти анализы оказались высоковоспроизводимыми и чувствительными к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает их ценными инструментами для изучения нейронных цепей и молекулярных механизмов, лежащих в основе поведения. Кроме того, эти анализы могут быть использованы при скрининге лекарств для выявления соединений, которые могут быть потенциальными модуляторами поведения.
В этой работе мы покажем, как применять поведенческие инструменты в нейротоксикологии рыб, анализируя действие метамфетамина, рекреационного наркотика, и глифосата, загрязнителя окружающей среды. Результаты демонстрируют значительный вклад поведенческих анализов на взрослых рыбках данио-рерио в понимание нейротоксикологических эффектов загрязнителей окружающей среды и лекарств, а также дают представление о молекулярных механизмах, которые могут изменять функцию нейронов.
Introduction
Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является популярным модельным видом позвоночных для экотоксикологии, разработки лекарств и фармакологических исследований безопасности. Его низкая стоимость, хорошо зарекомендовавший себя молекулярно-генетический инструментарий и сохранение ключевых физиологических процессов, участвующих в морфогенезе и поддержании нервной системы, делают рыбку данио-рерио идеальной животной моделью для исследований в области нейробиологии, включая нейроповеденческую токсикологию 1,2. Основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества до недавнего времени было наличие невропатологических эффектов. Однако в последнее время поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные исходы в настоящее время широко используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ 3,4. Более того, поведенческие конечные точки очень важны с экологической точки зрения, поскольку даже очень незначительные изменения в поведении рыб могут поставить под угрозу выживание животного в естественныхусловиях.
Одним из наиболее часто используемых поведенческих тестов в исследованиях взрослых рыбок данио является новый резервуарный тест (NTT), который измеряет тревожное поведение 6,7. В этом анализе рыбы подвергаются воздействию новизны (рыбы помещаются в незнакомый аквариум), мягкого аверсивного раздражителя и наблюдаются их поведенческие реакции. НТТ используется в основном для оценки базальной локомоторной активности, геотаксиса, замерзания и беспорядочных движений рыб. Неустойчивая8 характеризуется резкими изменениями направления (зигзагами) и повторяющимися эпизодами ускорений (рывок). Это тревожная реакция, которая обычно наблюдается до или после эпизодов замерзания. Поведение замерзания соответствует полному прекращению движений рыбы (за исключением оперкулярных и глазных движений) во время нахождения на дне аквариума, в отличие от неподвижности, вызванной седацией, которая вызывает гиполокомоцию, акинезию и погружение8. Замерзание обычно связано с высоким уровнем стресса и тревоги, а также является частью покорного поведения. Сложное поведение является отличным индикатором состояния беспокойства животных. Былопоказано, что НТТ чувствительна к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает ее ценным инструментом для изучения нейронной основы тревоги и связанных с ней расстройств.
Рыбки данио-рерио являются очень социальным видом, поэтому мы можем измерить широкий спектр социального поведения. Тест на мелководье (ST) и тест социальных предпочтений (SPT) являются наиболее часто используемыми тестами для оценки социального поведения10. ST измеряет склонность рыб группироватьсявместе 11 путем количественной оценки их пространственного поведения и моделей движения. ST полезен для изучения групповой динамики, лидерства, социального обучения и понимания социального поведения многих видов рыб12. SPT у взрослых рыбок данио-рерио был адаптирован из теста Кроули на социальную новизну для мышей13 и быстро стал популярным поведенческим тестом для изучения социального взаимодействия у этого модельноговида. Эти два теста также были адаптированы для использования в скрининговых тестах на наркотики и показали перспективность для выявления новых соединений, которые модулируют социальное поведение15,16.
В целом, поведенческие анализы у взрослых рыбок данио-рерио являются мощными инструментами, которые могут предоставить ценную информацию о механизмах поведения или нейрофенотипах активных соединенийи злоупотребляемых наркотиков. В этом протоколе подробно описывается, как реализовать эти поведенческие инструменты7 с базовыми материальными ресурсами и как применять их в анализах токсичности для характеристики эффектов широкого спектра нейроактивных соединений. Кроме того, мы увидим, что те же самые тесты могут быть применены для оценки нейроповеденческих эффектов острого воздействия нейроактивного соединения (метамфетамина), а также для характеристики этих эффектов после хронического воздействия концентраций пестицида (глифосата) в окружающей среде.
Protocol
Representative Results
Discussion
Характерное тревожное поведение, наблюдаемое при НТТ, положительно коррелировало с уровнями серотонина, проанализированными в мозге21. Например, после воздействия парахлорфенилаланина (PCPA), ингибитора биосинтеза 5-НТ, у рыб наблюдался положительный геотаксис, а также сниж?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана “Agencia Estatal de Investigación” Министерства науки и инноваций Испании (проект PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Центром передового опыта Северо Очоа (CEX2018-000794-S). Джульетт Бедроссианц получила грант (PRE2018-083513), софинансируемый правительством Испании и Европейским социальным фондом (ESF).
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- . Social behavior in Zebrafish Available from: https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012)
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, (2005).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., Kalueff, A., Cachat, J., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. 51, (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
