연수막 림프 내피 세포의 수확 및 1차 배양

Summary

최근에 확인된 두개내 세포 유형인 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 기능이 잘 이해되지 않습니다. 이 연구는 마우스에서 LLEC를 수확하고 시험관 내 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 LLEC의 세포 기능과 잠재적인 임상적 영향을 탐구할 수 있도록 설계되었습니다.

Abstract

연수막 림프 내피 세포(LEC)는 최근에 발견된 두개내 세포 집단으로, 말초 림프 내피 세포와 명확하게 구별되는 독특한 분포를 가지고 있습니다. 그들의 세포 기능과 임상적 의미는 거의 알려지지 않았습니다. 결과적으로, LLEC의 공급은 체외에서 기능적 연구를 수행하는 데 필수적입니다. 그러나 현재 시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 없습니다.

이 연구는 플라스크를 피브로넥틴으로 코팅하고, 현미경을 사용하여 렙토메닝을 해부하고, 렙토메닝을 효소로 소화하여 단세포 현탁액을 준비하고, 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)로 LLEC의 확장을 유도하고, 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 림프관 히알루론산 수용체-1(LYVE-1) 양성 세포를 선택하는 등 다단계 프로토콜을 사용하여 LLEC를 성공적으로 수확했습니다. 이 과정은 궁극적으로 1차 문화의 확립으로 이어졌다. LLEC의 순도는 면역형광 염색 및 유세포 분석을 통해 확인되었으며, 순도는 95%를 초과했습니다. 이 다단계 프로토콜은 재현성과 타당성을 입증했으며, 이는 LLEC의 세포 기능 및 임상적 의미에 대한 탐구를 크게 촉진할 것입니다.

Introduction

새로 발견된 렙토메닝 림프 내피 세포(LEC)는 렙토메닝 내에서 개별 세포의 그물망을 형성하여 말초 림프 내피 세포와 비교할 때 뚜렷한 분포 패턴을 나타냅니다 ^1,2. LLEC와 관련된 세포 기능 및 임상적 의미는 여전히 미지의 영역으로 남아 있습니다. LLEC에 대한 기능적 연구의 길을 닦기 위해서는 연구를 위한 체외 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 따라서 본 연구는 LLEC의 격리 및 1차 배양에 대한 포괄적인 프로토콜을 고안했습니다.

마우스는 질병 연구에서 유전자 조작에 적합하기 때문에 선호되는 동물 모델입니다. 이전 연구에서는 림프절³, 장간막 조직⁴, 피부 조직⁵, 수집 림프관⁶ 및 폐 조직⁷을 포함한 다양한 마우스 조직에서 림프 내피 세포를 성공적으로 분리했습니다. 이러한 분리 절차는 주로 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 유세포 분석^분류 8,9,10과 같은 기술에 의존해 왔습니다. 또한, 연구 노력은 쥐 거미막 세포주와 쥐 림프 모세관 세포주^11,12의 확립으로 이어졌습니다. 렙토메닝(leptomeninges)에 대한 외식물 배양 기법이 존재함에도 불구하고(¹³), LLEC의 분리 및 배양을 위한 표준화된 프로토콜이 시급히 필요하다. 결과적으로 이 연구는 현미경의 유도 하에 렙토메닝을 꼼꼼하게 해리하고 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)를 사용하여 LLEC의 확장을 촉진하여 LLEC를 성공적으로 수확 및 배양했습니다. 림프 내피 세포의 독특한 표지자는 림프관 히알루론산 수용체-1(lyve-1)입니다¹⁴. 이 다단계 프로토콜은 MACS를 사용하여 LYVE-1 양성 LLEC를 선택적으로 분리한 후 유세포 분석 및 면역형광 염색을 통해 순도를 검증합니다.

이 다단계 프로토콜의 주요 단계는 플라스크 코팅, 렙토메닝의 해리, 렙토메닝의 효소 분해, 세포 확장, 자기 세포 선택 및 LLEC의 후속 배양으로 요약할 수 있습니다. 마지막으로, 분리된 LLEC의 순도는 유세포 분석 및 면역형광 염색을 통해 확인됩니다. 이 연구의 가장 중요한 목표는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 분리하고 후속 시험관 내 배양을 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이 프로토콜은 LLEC의 세포 기능 및 임상적 영향에 대한 조사를 크게 촉진할 준비가 되어 있습니다.

Protocol

본 연구는 쿤밍의과대학 동물실험윤리위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았다. 모든 실험은 확립된 동물 관리 지침을 준수했습니다. 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 6-8주 되고 체중이 20-25g인 수컷 C57Bl/6J 마우스로부터 수확했습니다. 이 쥐들은 중국 쿤밍에 있는 쿤밍 의과대학에서 조달했다. 전체 실험 절차는 엄격한 멸균 조건에서 수행되었습니다. 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서…

Representative Results

이 연구는 생쥐에서 림프 내피 세포(LEC)를 채취한 후 시험관 내에서 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시합니다. 주요 단계에는 플라스크 준비 및 피브로넥틴 코팅, 렙토메닝의 해리, 효소 분해를 통한 단세포 현탁액 획득, VEGF-C로 LLEC 확장 유도가 포함됩니다. 그런 다음 LYVE-1 양성 LLEC를 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 선택적으로 분리합니다. 마지막으로, …

Discussion

시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 이전에 보고된 적이 없습니다. 이 연구는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 재현 가능한 다중 절차 프로토콜을 소개합니다.

이 다중 절차 프로토콜은 재현 가능하지만 몇 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 예를 들어, 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크는 비부착 세포를 제거함으로써 LLEC의 ?…

Materials

Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C