Beeldvorming van vitale en niet-vitale hersenpericyten in hersenplakjes na een subarachnoïdale bloeding
Summary
Het voorlopige onderzoek bevestigt dat subarachnoïdale bloeding (SAH) het overlijden van de pericyten in de hersenen veroorzaakt. Het evalueren van de contractiliteit van pericyten na SAH vereist differentiatie tussen levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten. Daarom is er een procedure ontwikkeld om levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten gelijktijdig in hersensecties te labelen, waardoor observatie met behulp van een confocale microscoop met hoge resolutie wordt vergemakkelijkt.
Abstract
Pericyten zijn cruciale wandcellen die zich in de cerebrale microcirculatie bevinden en cruciaal zijn voor het actief moduleren van de cerebrale bloedstroom via contractiliteitsaanpassingen. Conventioneel wordt hun contractiliteit gemeten door het observeren van morfologische verschuivingen en nabijgelegen capillaire diameterveranderingen onder specifieke omstandigheden. Toch komt de fixatie na weefsel, het evalueren van de vitaliteit en de daaruit voortvloeiende contractiliteit van de pericyten van de afgebeelde hersenpericyten in het gedrang. Evenzo schiet het genetisch labelen van hersenpericyten tekort in het onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare pericyten, met name bij neurologische aandoeningen zoals subarachnoïdale bloeding (SAH), waar ons voorlopige onderzoek de dood van hersenpericyten valideert. Er is een betrouwbaar protocol bedacht om deze beperkingen te overwinnen, waardoor gelijktijdige fluorescerende tagging van zowel functionele als niet-functionele hersenpericyten in hersensecties mogelijk wordt. Deze labelmethode maakt confocale microscoopvisualisatie met hoge resolutie mogelijk, waarbij tegelijkertijd de microvasculatuur van de hersenplak wordt gemarkeerd. Dit innovatieve protocol biedt een middel om de contractiliteit van de pericyten in de hersenen, de impact ervan op de capillaire diameter en de pericytenstructuur te beoordelen. Het onderzoeken van de contractiliteit van de pericyten in de hersenen binnen de SAH-context levert een inzichtelijk begrip op van de effecten ervan op de cerebrale microcirculatie.
Introduction
Hersenpericyten, die zich onderscheiden door hun slanke uitsteeksels en uitstekende cellichamen, omringen de microcirculatie 1,2. Terwijl de vergroting van de cerebrale bloedstroom voornamelijk wordt aangedreven door capillaire verwijding, vertonen kleinere slagaders langzamere verwijdingssnelheden3. De contractiliteit van pericyten oefent invloed uit op de capillaire diameter en de morfologie van pericyten, wat van invloed is op de vasculaire dynamica4. Samentrekking van hersenpericyten leidt tot capillaire vernauwing en in pathologische scenario’s kan overmatige contractie de erytrocytenstroom belemmeren5. Verschillende factoren, waaronder noradrenaline die vrijkomt uit de locus coeruleus, kunnen samentrekking van de pericyten in de hersenen in haarvaten induceren6. Met een regulerende rol in de cerebrale bloedstroom, vertonen pericyten 20-HETE-synthese, die dient als zuurstofsensor tijdens hyperoxie7. Oxidatieve-nitratieve stress-getriggerde samentrekking van hersenpericyten heeft een nadelige invloed op de haarvaten5. Ondanks zowel in vivo als ex vivo onderzoek naar samentrekking van pericyten in de hersenen8, blijft er beperkte kennis bestaan over de beeldvorming van levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten de hersenplakjes.
Cruciaal is dat beeldvorming van hersenpericyten na weefselfixatie hun vitaliteit en de daaropvolgende contractiliteitsbeoordeling in gevaar brengt. Bovendien, in scenario’s zoals neurologische aandoeningen (bijv. subarachnoïdale bloeding – SAH), maakt transgene etikettering van hersenpericyten geen onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare pericyten, zoals bevestigd door onze voorlopige SAH-geïnduceerde hersenpericytensterfte9.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, gebruikten we TO-PRO-3 om levende pericyten te labelen, terwijl overleden pericyten werden gekleurd met propidiumjodide (PI). We gebruikten confocale beeldvormingstechnologieën met hoge resolutie om levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten in hersenplakjes te visualiseren met behoud van schijfactiviteit tijdens beeldvorming. Dit artikel heeft tot doel een reproduceerbare methode te presenteren voor het afbeelden van levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten in hersenplakjes, die dienen als een waardevol hulpmiddel om de impact van hersenpericyten op de cerebrale microcirculatie na SAH te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn confocale beeldvormingstechnieken met hoge resolutie ontwikkeld voor het visualiseren van vitale hersenpericyten, niet-vitale hersenpericyten en de microvasculatuur in hersenplakjes. In acute plakjes hersenen van ratten omvat het proces de eerste labeling van pericyten met TO-PRO-311, gevolgd door microvasculaire endotheelcellen met IB412; vervolgens wordt de identificatie van overleden pericyten uitgevoerd met behulp van PI. Dit protocol is eenvoudig, reproduceerba…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); de Stichting voor Natuurwetenschappen van de provincie Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
