くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング
Summary
予備調査では、くも膜下出血(SAH)が脳周皮細胞の死にを引き起こすことが確認されています。SAH後の周皮細胞の収縮性を評価するには、生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を区別する必要があります。そこで、高分解能共焦点顕微鏡を用いた観察を容易にするために、脳切片で生存可能な脳周皮細胞と非生存脳周皮細胞を同時に標識する手順が開発されました。
Abstract
周皮細胞は、脳の微小循環内に位置する重要な壁細胞であり、収縮性の調整を介して脳の血流を積極的に調節する上で極めて重要です。従来、それらの収縮性は、特定の状況下での形態学的変化と近くの毛細血管直径の変化を観察することによって測定されていました。しかし、組織固定後の活力の評価と、それに続く画像化された脳周皮細胞の周皮細胞の収縮性が損なわれます。同様に、脳周皮細胞の遺伝的標識は、特にくも膜下出血(SAH)などの神経学的状態において、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別するのに不十分であり、予備調査で脳周皮細胞の死が検証されています。これらの制約を克服するために信頼性の高いプロトコルが考案され、脳切片の機能的および非機能的な脳周皮細胞の両方の蛍光タグ付けが可能になりました。この標識法により、高解像度の共焦点顕微鏡による可視化が可能になり、同時に脳スライスの微小血管系をマーキングすることができます。この革新的なプロトコルは、脳周皮細胞の収縮性、毛細血管径への影響、および周皮皮構造を評価する手段を提供します。SAHの文脈の中で脳周皮細胞の収縮性を調べることで、脳微小循環に対するその影響についての洞察に満ちた理解が得られます。
Introduction
脳周皮細胞は、細い隆起と突出した細胞体によって区別され、微小循環を取り囲んでいます1,2。脳血流増強は主に毛細血管拡張によって引き起こされるが、細い動脈は拡張速度が遅い3。ペリサイトの収縮性は、毛細血管径とペリサイトの形態に影響を与え、血管動態に影響を与えます4。脳周皮細胞の収縮は毛細血管収縮につながり、病理学的シナリオでは、過度の収縮が赤血球の流れを妨げる可能性があります5。座骨髄から放出されるノルエピネフリンを含むさまざまな要因が、毛細血管内の脳周皮細胞の収縮を誘発する可能性があります6。ペリサイトは、脳血流の調節に関与し、20-HETE合成を示し、高酸素症の際に酸素センサーとして機能します7。酸化的・硝化的ストレスによる脳周皮細胞の収縮は毛細血管に悪影響を及ぼす5.脳周皮細胞の収縮に関するin vivoおよびex vivoの両方の研究にもかかわらず8、脳スライス内の生存可能および非生存可能な脳周皮細胞のイメージングに関する限られた知識が残っています。
重要なことに、脳周皮細胞の組織固定後のイメージングは、それらの活力とその後の収縮性評価を損ないます。さらに、神経疾患(くも膜下出血など-SAH)などのシナリオでは、脳周皮細胞のトランスジェニック標識は、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別できないことが、予備的なSAH誘発性脳周皮細胞死研究によって確認されています9。
これらの課題を克服するために、TO-PRO-3を使用して生きた周皮細胞を標識し、死亡したペリサイトはヨウ化プロピジウム(PI)で染色しました。高解像度の共焦点イメージング技術を使用して、イメージング中にスライス活性を維持しながら、脳スライス内の生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を視覚化しました。本稿は、SAH後の脳微小循環に対する脳周皮細胞の影響を調査するための貴重なツールとして役立つ、脳スライス中の生存可能および非生存の脳周皮細胞をイメージングするための再現性のある方法を提示することを目的としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
重要な脳周皮細胞、非重要な脳周皮細胞、および脳スライスの微小血管系を視覚化するための高解像度共焦点イメージング技術を開発しました。急性ラットの脳切片では、このプロセスでは、TO-PRO-311による周皮細胞の最初の標識、続いてIB412による微小血管内皮細胞の標識が伴います。その後、PIを用いて死亡した周皮細胞の同定を行います。このプロト?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(81960226,81760223)からの助成金によって支援されました。雲南省自然科学財団(202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
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