Avbildning av vitala och icke-vitala hjärnpericyter i hjärnskivor efter subaraknoidalblödning
Summary
Förundersökningen bekräftar att subaraknoidalblödning (SAH) orsakar hjärnans pericytdöd. Utvärdering av pericytkontraktilitet efter SAH kräver differentiering mellan livskraftiga och icke-livskraftiga pericyter i hjärnan. Därför har en procedur utvecklats för att märka livskraftiga och icke-livskraftiga pericyter i hjärnan samtidigt, vilket underlättar observation med hjälp av ett högupplöst konfokalmikroskop.
Abstract
Pericyter är viktiga väggceller som ligger i hjärnans mikrocirkulation och som är avgörande för att aktivt modulera hjärnans blodflöde via kontraktilitetsjusteringar. Konventionellt mäts deras kontraktilitet genom att observera morfologiska förändringar och närliggande kapillärdiameterförändringar under specifika omständigheter. Ändå äventyras postvävnadsfixering, utvärdering av vitalitet och påföljande pericytkontraktilitet hos avbildade hjärnpericyter. På samma sätt misslyckas genetisk märkning av hjärnpericyter med att skilja mellan livskraftiga och icke-livskraftiga pericyter, särskilt vid neurologiska tillstånd som subaraknoidalblödning (SAH), där vår preliminära undersökning bekräftar hjärnans pericytdöd. Ett tillförlitligt protokoll har tagits fram för att övervinna dessa begränsningar, vilket möjliggör samtidig fluorescerande märkning av både funktionella och icke-funktionella hjärnpericyter i hjärnsnitt. Denna märkningsmetod möjliggör högupplöst visualisering av konfokalmikroskop, samtidigt som den markerar hjärnskivans mikrovaskulatur. Detta innovativa protokoll erbjuder ett sätt att bedöma hjärnans pericytkontraktilitet, dess inverkan på kapillärdiametern och pericytstrukturen. Att undersöka hjärnans pericytkontraktilitet inom SAH-kontexten ger en insiktsfull förståelse för dess effekter på hjärnans mikrocirkulation.
Introduction
Hjärnans pericyter, som kännetecknas av sina smala utbuktningar och utskjutande cellkroppar, omger mikrocirkulationen 1,2. Medan cerebral blodflödesförstärkning främst drivs av kapillärutvidgning, uppvisar mindre artärer långsammare dilatationshastigheter3. Pericytkontraktilitet utövar inflytande över kapillärdiameter och pericytmorfologi, vilket påverkar vaskulär dynamik4. Sammandragning av hjärnans pericyter leder till kapillärsammandragning, och i patologiska scenarier kan överdriven kontraktion hindra erytrocytflödet5. Olika faktorer, inklusive noradrenalin som frigörs från locus coeruleus, kan inducera hjärnans pericytsammandragning i kapillärerna6. Med en reglerande roll i cerebralt blodflöde uppvisar pericyter 20-HETE-syntes och fungerar som en syresensor under hyperoxi7. Oxidativ-nitrativ stressutlöst sammandragning av hjärnans pericyter påverkar kapillärernanegativt 5. Trots både in vivo- och ex vivo-undersökningar av hjärnans pericytkontraktion8 kvarstår begränsad kunskap om avbildning av livskraftiga och icke-livskraftiga hjärnpericyter i hjärnskivor.
Avgörande är att avbildning av hjärnpericyter efter vävnadsfixering äventyrar deras vitalitet och efterföljande bedömning av kontraktilitet. Dessutom, i scenarier som neurologiska störningar (t.ex. subaraknoidalblödning – SAH), misslyckas transgen märkning av hjärnpericyter med att skilja mellan livskraftiga och icke-livskraftiga pericyter, vilket bekräftas av vår preliminära SAH-inducerade hjärnpericytdödsstudie9.
För att övervinna dessa utmaningar använde vi TO-PRO-3 för att märka levande pericyter, medan avlidna var färgade med propidiumjodid (PI). Vi använde högupplösta konfokala avbildningstekniker för att visualisera livskraftiga och icke-livskraftiga hjärnpericyter i hjärnskivor samtidigt som skivaktiviteten bevarades under avbildningen. Denna artikel syftar till att presentera en reproducerbar metod för avbildning av livskraftiga och icke-livskraftiga hjärnpericyter i hjärnskivor, vilket fungerar som ett värdefullt verktyg för att undersöka effekten av hjärnpericyter på cerebral mikrocirkulation efter SAH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklade är högupplösta konfokala avbildningstekniker för att visualisera vitala hjärnpericyter, icke-vitala hjärnpericyter och mikrovaskulaturen i hjärnskivor. I akuta hjärnskivor hos råttor innebär processen initial märkning av pericyter med TO-PRO-311, följt av mikrovaskulära endotelceller med IB412; Därefter utförs identifiering av avlidna pericyter med hjälp av PI. Detta protokoll är enkelt, reproducerbart och mycket tillämpligt för funktionell for…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien finansierades av anslag från National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); Naturvetenskapliga stiftelsen i provinsen Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
