Her beskriver vi en metode for tarmisolering fra sebrafisklarver 5 dager etter befruktning, for encellet RNA-sekvenseringsanalyse.
Den gastrointestinale (GI) -kanalen utfører en rekke funksjoner som er avgjørende for livet. Medfødte defekter som påvirker utviklingen kan føre til enteriske nevromuskulære lidelser, og fremhever viktigheten av å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for GI-utvikling og dysfunksjon. I denne studien presenterer vi en metode for tarmisolering fra sebrafisklarver 5 dager etter befruktning for å oppnå levende, levedyktige celler som kan brukes til encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) analyse. Denne protokollen er basert på manuell disseksjon av sebrafisktarmen, etterfulgt av enzymatisk dissosiasjon med papain. Deretter blir celler sendt til fluorescensaktivert cellesortering, og levedyktige celler samles for scRNA-seq. Med denne metoden var vi i stand til å identifisere forskjellige tarmcelletyper, inkludert epitel-, stromal-, blod-, muskel- og immunceller, samt enteriske nevroner og glia. Derfor anser vi det for å være en verdifull ressurs for å studere sammensetningen av GI-kanalen i helse og sykdom, ved hjelp av sebrafisken.
Mage-tarmkanalen (GI) er et komplekst system som spiller en viktig rolle i generell helse og velvære. Det er ansvarlig for fordøyelsen og absorpsjonen av næringsstoffer, samt eliminering av avfallsprodukter 1,2. GI-kanalen består av flere celletyper, inkludert epitelceller, glatte muskelceller, immunceller og det enteriske nervesystemet (ENS), som kommuniserer tett sammen for å regulere og opprettholde riktig tarmfunksjon 3,4,5. Defekter i utviklingen av GI-kanalen kan ha vidtgående effekter på ulike aspekter som næringsopptak, mikrobiotasammensetning, tarm-hjerneaksen og ENS, noe som fører til flere enteriske nevromuskulære lidelser, som Hirschsprung sykdom og Kronisk intestinal pseudoobstruksjon 6,7. Disse lidelsene kjennetegnes av alvorlig tarmdysmotilitet forårsaket av endringer i forskjellige nøkkelceller, som interstitielle celler i Cajal, glatte muskelceller og ENS 6,8,9. Imidlertid er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for GI-utvikling og dysfunksjon fortsatt dårlig forstått.
Sebrafisken er en verdifull modellorganisme for å studere GI-utvikling og dysfunksjon på grunn av sin raske embryonale utvikling, gjennomsiktighet under embryonale stadier og larvestadier og genetisk trekkbarhet 10,11,12,13,14. Tallrike transgene sebrafisklinjer som uttrykker fluorescerende proteiner er tilgjengelige. Et eksempel på en slik linje er tg (phox2bb: GFP) sebrafisk, som vanligvis brukes til å studere ENS, da alle phox2bb + -celler, inkludert enteriske nevroner, er merket15,16. Her presenterer vi ved hjelp av tg(phox2bb:GFP) sebrafisklinjen en metode for tarmisolering på 5 dager etter befruktning (dpf) larver for encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) analyse (figur 1).
Her presenterer vi en metode for isolering og dissosiasjon av tarmen hos 5 dpf sebrafisklarver ved bruk av FACS. Med denne metoden ble forskjellige tarmcelletyper vellykket samlet og analysert av scRNA-seq, ved hjelp av 10x Genomics Chromium-plattformen. Vi valgte tg(phox2bb:GFP)-sebrafisklinjen, da vi ønsket en indikasjon på at levedyktige ENS-celler også ville være isolerte (figur 2D). Det er imidlertid viktig å merke seg at denne metoden lett kan utvides til andre sebrafiskl…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av venner av Sophia Foundation (SSWO WAR-63).
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |