Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única
Summary
Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.
Abstract
O trato gastrointestinal (GI) desempenha uma série de funções essenciais para a vida. Defeitos congênitos que afetam seu desenvolvimento podem levar a distúrbios neuromusculares entéricos, ressaltando a importância da compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal. Neste estudo, apresentamos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias pós-fertilização para obtenção de células vivas viáveis que podem ser usadas para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Este protocolo baseia-se na dissecção manual do intestino do peixe-zebra, seguida de dissociação enzimática com papaína. Posteriormente, as células são submetidas à triagem celular ativada por fluorescência, e células viáveis são coletadas para scRNA-seq. Com esse método, conseguimos identificar com sucesso diferentes tipos de células intestinais, incluindo células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares e imunes, bem como neurônios entéricos e glia. Portanto, consideramos ser um recurso valioso para o estudo da composição do trato gastrointestinal na saúde e na doença, utilizando o peixe-zebra.
Introduction
O trato gastrointestinal (GI) é um sistema complexo que desempenha um papel vital na saúde geral e bem-estar. É responsável pela digestão e absorção de nutrientes, bem como pela eliminação de resíduos 1,2. O trato gastrointestinal é composto por múltiplos tipos celulares, incluindo células epiteliais, células musculares lisas, células imunes e sistema nervoso entérico (ENS), que se comunicam estreitamente para regular e manter a função intestinal adequada 3,4,5. Defeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal podem ter efeitos de longo alcance em vários aspectos, como absorção de nutrientes, composição da microbiota, eixo intestino-cérebro e ENS, levando a vários distúrbios neuromusculares entéricos, como a doença de Hirschsprung e a pseudo-obstrução intestinal crônica 6,7. Esses distúrbios são caracterizados por dismotilidade intestinal grave causada por alterações em várias células-chave, como as células intersticiais de Cajal, as células musculares lisas e a ENS 6,8,9. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal ainda são pouco compreendidos.
O peixe-zebra é um valioso organismo modelo para estudar o desenvolvimento e a disfunção gastrointestinal devido ao seu rápido desenvolvimento embrionário, transparência durante os estágios embrionário e larval e tratabilidade genética 10,11,12,13,14. Numerosas linhagens transgênicas de zebrafish expressando proteínas fluorescentes estão disponíveis. Um exemplo dessa linhagem é o peixe-zebra tg(phox2bb:GFP), comumente usado para estudar a ENS, pois todas as células phox2bb+, incluindo os neurônios entéricos, são marcadas15,16. Aqui, usando a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), apresentamos um método de isolamento intestinal de larvas 5 dias pós-fertilização (dpf) para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um método para isolamento e dissociação do intestino de larvas de 5 dpf de zebrafish usando FACS. Com este método, diferentes tipos celulares intestinais foram coletados e analisados com sucesso por scRNA-seq, utilizando a plataforma 10x Genomics Chromium. Selecionamos a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), pois queríamos uma indicação de que células viáveis do ENS também seriam isoladas (Figura 2D). No entanto, é importante notar que este método pod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos amigos da Fundação Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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