Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.

Abstract

Der Magen-Darm-Trakt erfüllt eine Reihe von Funktionen, die für das Leben unerlässlich sind. Angeborene Defekte, die seine Entwicklung beeinträchtigen, können zu enterischen neuromuskulären Erkrankungen führen, was unterstreicht, wie wichtig es ist, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung vor, um lebende, lebensfähige Zellen zu erhalten, die für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) verwendet werden können. Dieses Protokoll basiert auf der manuellen Dissektion des Zebrafischdarms, gefolgt von der enzymatischen Dissoziation mit Papain. Anschließend werden die Zellen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unterzogen und lebensfähige Zellen für die scRNA-Sequenzierung gesammelt. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich verschiedene Darmzelltypen identifizieren, darunter Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel- und Immunzellen sowie enterische Neuronen und Gliazellen. Daher betrachten wir es als eine wertvolle Ressource, um die Zusammensetzung des Magen-Darm-Trakts bei Gesundheit und Krankheit anhand des Zebrafisches zu untersuchen.

Introduction

Der Magen-Darm-Trakt ist ein komplexes System, das eine wichtige Rolle für die allgemeine Gesundheit und das Wohlbefinden spielt. Es ist für die Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen sowie für die Ausscheidung von Abfallprodukten^{verantwortlich 1,2}. Der Magen-Darm-Trakt besteht aus mehreren Zelltypen, darunter Epithelzellen, glatte Muskelzellen, Immunzellen und das enterische Nervensystem (ENS), die eng miteinander kommunizieren, um die ordnungsgemäße Darmfunktion zu regulieren und aufrechtzuerhalten ^3,4,5. Defekte in der Entwicklung des Magen-Darm-Trakts können weitreichende Auswirkungen auf verschiedene Aspekte wie die Nährstoffaufnahme, die Zusammensetzung der Mikrobiota, die Darm-Hirn-Achse und das ENS haben und zu verschiedenen enterischen neuromuskulären Erkrankungen wie Morbus Hirschsprung und chronischer intestinaler Pseudoobstruktion führen ^6,7. Diese Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine schwere Darmdysmotilität, die durch Veränderungen in verschiedenen Schlüsselzellen verursacht wird, wie z. B. den interstitiellen Zellen des Cajal, den glatten Muskelzellen und dem ENS ^6,8,9. Die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen, sind jedoch noch wenig verstanden.

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner schnellen Embryonalentwicklung, seiner Transparenz während des Embryonal- und Larvenstadiums und seiner genetischen Lenkbarkeit ein wertvoller Modellorganismus für die Untersuchung der Magen-Darm-Entwicklung und -Dysfunktion 10,11,12,13,14. Es stehen zahlreiche transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Ein Beispiel für eine solche Linie ist der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafisch, der häufig zur Untersuchung des ENS verwendet wird, da alle phox2bb+-Zellen, einschließlich enterischer Neuronen, mit^15,16 markiert sind. In dieser Arbeit stellen wir unter Verwendung der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie eine Methode zur Darmisolierung von Larven nach der Befruchtung (dpf) für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)-Analyse vor (Abbildung 1).

Protocol

Alle Zebrafischhaltungen und -versuche wurden nach den institutionellen Richtlinien des Erasmus MC und der Tierschutzgesetzgebung durchgeführt. Die Verwendung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung fällt unter die Kategorie der Experimente, die keine formelle ethische Genehmigung erfordern, wie es in den niederländischen Vorschriften festgelegt ist. 1. Gewinnung von 5 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Wildtyp- und tg(phox2bb:GFP)-Larven Richten S…

Representative Results

Mit diesem Protokoll gelang es uns, den gesamten Darm von 5-dpf-Larven zu isolieren und zu dissoziieren. Durch die Verwendung von Papain als Dissoziationsenzym haben wir die Zelllebensfähigkeit signifikant verbessert und die Erfassung von 46.139 Ereignissen mit einzelnen, lebensfähigen Zellen (6,4 % aller Zellen) aus 244 isolierten Eingeweiden ermöglicht (Abbildung 2A). Als Kontrolle wurden ganze Wildtyp-Larven verwendet, um sicherzustellen, dass der Sortierprozess optimiert wurde, was ei…

Discussion

Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung und Dissoziation des Darms von 5 dpf Zebrafischlarven mittels FACS vor. Mit dieser Methode wurden verschiedene Darmzelltypen erfolgreich gesammelt und mittels scRNA-seq unter Verwendung der 10x Genomics Chromium-Plattform analysiert. Wir haben uns für die tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie entschieden, da wir einen Hinweis darauf haben wollten, dass auch lebensfähige ENS-Zellen isoliert werden (Abbildung 2D). Es ist jedoch wichtig zu beach…

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154