Här beskrivs en metod för att mata Drosophila melanogaster med läkemedel och växtextrakt och bedöma deras effekt på mag-tarmkanalen genom att analysera bananflugornas avföringsavlagringar. De läkemedelsbehandlade flugorna kan användas som modell för vidare forskning.
För att studera människans mag-tarmfysiologi har biomedicinska forskare förlitat sig på användningen av modellorganismer. Även om många forskare har använt möss som modell för att studera tarmfunktionen, har endast ett fåtal rapporter fokuserat på Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Jämfört med möss har bananflugor många fördelar, såsom en kort livscykel, kostnadseffektivt och enkelt underhåll och inga etiska problem. Dessutom är däggdjurens gastrointestinala fysiologi, anatomi och signalvägar mycket bevarade i D. melanogaster. Växtextrakt har traditionellt använts för att behandla diarré och förstoppning. Till exempel är Psidium guajava (P. guajava) ett av de mest kända antidiarrémedlen i tropikerna. Inga studier har dock utvärderat effekten av antidiarré och laxermedel och växtextrakt i D. melanogaster, och det är fortfarande okänt om liknande effekter (t.ex. mindre, mer koncentrerade och mindre rikliga avföringsavlagringar när det gäller läkemedel mot diarré) kan förekomma hos bananflugor jämfört med däggdjur. I denna studie demonstreras en antidiarréeffekt inducerad av P. guajava i en D. melanogaster-stam som uppvisar en diarréfenotyp. Avföringsprovtagningen som flugorna producerar följs upp med hjälp av ett foder som innehåller tillsats av färgämnen. Detta protokoll beskriver den metod som används för att tillaga mat med läkemedel, utvärdera avföringsavlagringarna hos flugor som matas med dessa matberedningar och tolka de erhållna uppgifterna.
Mag-tarmkanalen (GI), även kallad matsmältningskanalen, ansvarar för matsmältningen och absorptionen av näringsämnen och utsöndringen av osmälta produkter1. Mag-tarmkanalen är sårbar för en rad sjukdomar som kan orsaka obehag, smärta och störningar i det dagliga livet. Gastrointestinala störningar inkluderar buksmärta och obehag, uppblåsthet, halsbränna, matsmältningsbesvär eller dyspepsi, illamående, kräkningar, diarré och förstoppning2. Diarré är det vanligaste symtomet på gastrointestinalsjukdom 3, och det definieras som en sjukdom med minst tre lösa och vattniga avföring under en 24-timmarsperiod4. Diarré orsakas av ett brett spektrum av patogener, inklusive bakterier, virus, parasiter, svampar, och kan också orsakas av läkemedel 5,6. Globalt sett fortsätter diarré att vara den näst vanligaste dödsorsaken bland barn under5 år. Även om diarré kan lösa sig själv, kan det också indikera ett allvarligare underliggande tillstånd om det varar i mer än några dagar.
För att studera tarmkanalen vänder sig forskarna till djurmodeller som möss, råttor och grisar 8,9. Användningen av dessa djur kan dock vara dyr och tidskrävande eftersom de kräver specialiserade faciliteter och etiska överväganden. Nyligen genomförda studier har visat att D. melanogaster kan användas som en modell för att studera mag-tarmkanalen och undersöka vissa mekanismer såsom upprätthållandet av regenerativ homeostas, utvecklingen av immunåldrande, förlusten av epitelbarriärfunktion och nedgången i metabolisk homeostas10,11. D. melanogaster, känd som bananflugan, delar en hög grad av genetisk homologi med människor; Cirka 75 % av människans sjukdomsgener tros ha en funktionell homolog hos fluga12. De har också ett enkelt matsmältningssystem som består av en framtarm, en mellantarm och en baktarm13. D. melanogaster är lätt att odla i laboratorium och kan genmodifieras på olika sätt14. Att använda D. melanogaster för in vivo-testning är därför ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för forskare att studera komplexa biologiska processer i en kontrollerad miljö.
Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) använder cirka 80 % av människorna som bor i utvecklingsländer traditionell medicin för sina primära hälsobehov15. Den höga användningen av medicinalväxter kan förklaras av att de är lättillgängliga, billiga och har fåbiverkningar. De viktigaste växtdelarna som används i örtterapi inkluderar blad, bark, rötter, frön17 medan de viktigaste beredningsmetoderna är infusion, avkok och maceration18. Dessa växtbaserade läkemedel innehåller fytokemiska ämnen som alkaloider, terpenoider, flavonoider, steroider, tanniner och kolhydrater19, som har terapeutiska effekter på människokroppen. Människor använder en mängd olika medicinalväxter för att behandla gastrointestinala störningar som diarré, magont och dysenteri20. Till exempel är Psidium guajava en av de mest använda växterna för att behandla diarré i världen. Olika farmakologiska och kliniska tester har redan visat dess säkerhet, vilket gör det till en bra antidiarrékandidat att studera21,22. De största begränsningarna med växtbaserade läkemedel är dock bristen på effektivitets- och säkerhetsbedömning, samt bristen på definitiv och fullständig information om sammansättningen av växtextrakt som används23. För att validera växtbaserade läkemedels effektivitet och säkerhet krävs ett systematiskt tillvägagångssätt som inbegriper experimentell och klinisk validering, och tillvägagångssättet bör stödjas av tillräckliga data från in vivo– och in vitro-studier.
För att utvärdera traditionella botemedel för deras effektivitet vid behandling av diarré har användningen av möss och råttor varit dominerande under de senaste decennierna24,25. På grund av de viktigaste fördelarna som nämnts tidigare, dvs användarvänlighet, prisvärda, replikerbara, bevarade absorptions- och matsmältningsfunktioner mellan flugor och däggdjur, föreslår vi att använda D. melanogaster som en modell för att utvärdera växternas antidiarréaktivitet. Den diarréiska fenotypen i D. melanogaster kan karakteriseras av flera egenskaper, inklusive ökat överflöd av fekala avlagringar, större avlagringar, en ljusare färgning (mindre koncentrerad) och högre fekalt material26. Denna fenotyp kan kvantifieras med hjälp av olika parametrar: antal fekala avlagringar, total yta av avlagringar, genomsnittlig ljushet och total integrerad optisk densitet (IOD). Total IOD definieras som det totala färgämnesinnehållet i avlagringen, vilket innebär det totala fekala materialet som utsöndras27. Tidigare har en analys utvecklats för att analysera fekala avlagringar av D. melanogaster27,28. I denna analys användes den ultimata avsaknaden (T.U.R.D.) som ett fekalt analysverktyg, vilket gör det möjligt att kontrollera antalet, storleken och lättheten hos avföringsavlagringar och därmed övervaka bananflugornas tarmfysiologi. Denna metod användes dock aldrig för att utvärdera den diarréiska fenotypen hos flugor. Ion Transport Peptide (ITP)-genen är en viktig endokrin regulator av törst och utsöndring och kombinerar vattenhomeostas med utfodring i D. melanogaster. I en nyligen genomförd studie visade det sig att hastigheten på mattransiteringen genom mag-tarmkanalen och frekvensen av avföringshändelser minskade av ITP-överuttryck och ökade av ITP-knockdown. Den senare fenotypen beskrevs som diarré av författarna till denna studie29.
I detta protokoll används en modifierad version av fekalavlagringsanalysen för att bedöma effekten av ett antidiarrémedel (dvs. guavabladsextrakt) på mag-tarmkanalen hos D. melanogaster genom att använda ITPi-stammen som en diarrémodell. Det övergripande målet med denna metod är: 1) att tillhandahålla en enkel och tillförlitlig metod för att utvärdera den antidiarréa effekten av läkemedel och växtextrakt, och 2) att möjliggöra upptäckten av bioaktiva föreningar som är ansvariga för antidiarréeffekten i växtextrakt genom att tillämpa ett bioaktivitetsstyrt tillvägagångssätt.
D. melanogaster har blivit allmänt accepterad som en modell för olika biologiska processer på grund av likheten i gener mellan D. melanogaster och människor36. Användningen av D. melanogaster som en modell för att studera tarmkanalen är utbredd och tillämpningen av T.U.R.D. har använts för att uppskatta antalet, arean och mängden avföringsavlagringar. Den fenotypiska detektionsmetoden har dock inte använts för att bedöma diarré hos bananflugor. Därför introducerar detta protokoll en ny metod för att grovt bedöma förekomsten av diarré genom att upptäcka avföringsavlagringarna.
Avföringsavlagringar är en viktig indikator på tarmkanalens funktion och hälsa37. I detta sammanhang föreslås en metod för uppfödning av D. melanogaster på läkemedelsinnehållande medium för att undersöka olika parametrar för fekala avlagringar. Genom att övervaka antalet avlagringar är det möjligt att bestämma avföringsfrekvensen och bedöma om ett läkemedel har någon inverkan på tarmtransiteringen. Den totala ytan av avlagringarna kan mätas för att utvärdera koncentrationen och utspädningen av fekalt material, vilket är en viktig faktor för att bestämma tarmkanalens allmänna hälsa. Dessutom kan den totala integrerade optiska densiteten (IOD) användas för att detektera den totala mängden fekalt material som finns i avlagringarna. Detta protokoll ger en effektiv metod för att screena och utvärdera läkemedel samt växtextrakt som påverkar tarmkanalen. När D. melanogaster används som modellorganism är det möjligt att bedöma effekten av potentiella läkemedel, vilket kan bidra till att påskynda läkemedelsupptäcktsprocessen. Genom att tillämpa denna metod på växtextrakt kan forskare hjälpa till att validera deras användning som medel mot diarré.
Det finns flera viktiga steg att tänka på när du använder detta protokoll för att studera fekala avlagringar i D. melanogaster. För det första är det viktigt att beräkna den massa som krävs för att uppnå önskad koncentration av läkemedlet i mediet. Dessutom är det viktigt att säkerställa god förberedelse när du tillsätter läkemedlet till mediet, eftersom höga temperaturer kan försämra läkemedlet och påverka dess styrka. För det andra är urvalet av honflugor viktigt i detta protokoll. Det är viktigt att använda jungfruliga honflugor för att undvika skillnaderna i avföring mellan jungfruliga och parade honor. Till exempel är fläckarna som produceras av jungfruliga honor mer cirkulära än parade honor, och parade honor tenderar att utsöndra mer avföringsmaterial än jungfruliga honor27,28. Därför rekommenderas det att samla flugor före 8 timmars stängning för att säkerställa att alla honor som samlas in är jungfrur. Dessutom bör de testade flugorna vara starka och friska, eftersom deras hälsa kan påverka födointag och avföringsproduktion. Till exempel kan flugor med en normal form av vingar ha svårt att få maten. Slutligen, för att använda T.U.R.D. framgångsrikt, är blockstorleken (pixlar) och offsetinställningarna avgörande. På grund av skillnaden i ljuskontrasten i bilderna kan det vara nödvändigt att prova olika inställningar för att uppnå bästa möjliga identifiering av fekala avlagringar.
Även om den metod som presenteras är effektiv finns det flera begränsningar. En är noggrannheten i läkemedelskoncentrationen i mediet. Eftersom mediet värms upp under beredningen kan en del vatten avdunsta, vilket kan påverka koncentrationen av läkemedlet. En annan begränsning är skanningen av petriskålarna. Vissa delar av petriskålarna (t.ex. kanterna) skannas inte, och detta kan resultera i en felberäkning av de totala avlagringarna. Dessutom producerar flugorna inte samma mängd avföring på de övre och nedre locken på petriskålarna. Eftersom de tenderar att producera mer avlagringar på bottenlocket kan standardavvikelsen för analysen mellan topp- och bottenlocket vara hög, vilket kan påverka resultatens noggrannhet.
Med hjälp av detta protokoll kan forskare studera diarré hos D. melanogaster. Genom att modifiera det läkemedelsinnehållande mediet kan denna metod användas för att screena antidiarréväxter, vilket ger ett nytt tillvägagångssätt för läkemedelsupptäckt. Traditionell medicin och naturprodukter har använts i århundraden för att behandla olika sjukdomar, inklusive gastrointestinala störningar. Genom att använda detta protokoll för att utvärdera effekten av växtextrakt på fekala avlagringar kan potentiella nya behandlingar för tarmsjukdomar identifieras och en vetenskaplig grund för deras användning som antidiarrémedel kan tillhandahållas. Detta tillvägagångssätt kan ge ett värdefullt bidrag till området läkemedelsupptäckt och etnofarmakologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Martina Gáliková för att ha försett oss med Drosophila-stammarna . Vi är tacksamma för att Michelle Crozatier-Borde och Marc Haenlin har gett feedback på vår studie och hjälpt oss att förbättra vår modell. Vi vill tacka Napo Pharmaceuticals Company för att de har försett oss med läkemedlet Crofelemer. Författarna är också tacksamma mot gästredaktören Dr. Hugues Petitjean för att ha gett oss möjligheten att publicera detta protokoll. Denna studie finansierades av Agence Nationale de la Recherche (ANR) inom ramen för projektet ANR-22-CE03-0001-01.
Chemical & Food medium | |||
Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
Crofelemer | Napo pharmaceuticals | – | – |
Ethanol 96% | – | – | – |
Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
Materials | |||
Beaker | DWK LIFE SCIENCE | – | 250 mL |
Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
CO2 tank | – | – | – |
Erlen Meyer flask | – | – | 500 mL (for extraction) |
Filter paper grade | Whatman | – | 3 mm chr. |
Flowbuddy socle | Genesis | – | – |
Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | – |
Flystuff Blow gun | Genesis | – | – |
Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | – | – |
Flystuff Foot pedal | Genesis | – | – |
Forceps | Dumostar | 11295-51 | – |
Graduated cylinder | – | – | 100 mL |
Inox spatula | – | – | – |
Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | – |
Paintbrush | – | – | – |
Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
Round-bottom flask | – | – | 500 mL (for evaporation) |
Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
Whisk | – | – | – |
Equipments | |||
Chiller | HUBER | Minichiller | – |
Heating bath | BÜCHI | B-490 | – |
Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | – | Magnetic stirrer hot plate |
Incubator | Memmert | – | HPP110eco |
Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | – |
Scanner | Epson | V850 pro | – |
Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | – |
Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | – |
Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | – |
Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | – |