Her beskrives en metode for å mate Drosophila melanogaster med medisiner og planteekstrakter og vurdere deres effekt på mage-tarmkanalen ved å analysere fruktfluene fekale forekomster. De medikamentbehandlede fluene kan brukes som modell for videre forskning.
For å studere human gastrointestinal fysiologi har biomedisinske forskere stolt på bruk av modellorganismer. Selv om mange forskere har brukt mus som en modell for å studere tarmfunksjonen, har bare noen få rapporter fokusert på Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Sammenlignet med mus gir bananfluer mange fordeler, for eksempel kort livssyklus, kostnadseffektivt og enkelt vedlikehold, og ingen etiske problemer. Videre er pattedyrs gastrointestinale fysiologi, anatomi og signalveier sterkt bevart i D. melanogaster. Planteekstrakter har tradisjonelt blitt brukt til å behandle diaré og forstoppelse. For eksempel er Psidium guajava (P. guajava) et av de mest kjente antidiarrheal-midlene i tropene. Imidlertid har ingen studier evaluert effekten av antidiarrheal og avføringsmidler og planteekstrakter i D. melanogaster, og det er fortsatt ukjent om lignende effekter (f.eks. Mindre, mer konsentrert og mindre rikelig fekale forekomster i tilfelle av antidiarrheal drugs) kan forekomme i fruktfluene sammenlignet med pattedyr. I denne studien er en antidiarrheal effekt indusert av P. guajava demonstrert i en D. melanogaster stamme som presenterer en diaré fenotype. Fekal prøvetaking produsert av fluer overvåkes ved hjelp av en fargestoffsupplert mat. Denne protokollen skisserer metoden som brukes til å tilberede mat med narkotika, evaluere fekale forekomster av fluer matet på disse matpreparatene og tolke dataene som er oppnådd.
Mage-tarmkanalen (GI), også kalt fordøyelseskanalen, er ansvarlig for fordøyelsen og absorpsjonen av næringsstoffer og utskillelse av ufordøyde produkter1. GI-kanalen er sårbar for en rekke lidelser som kan forårsake ubehag, smerte og forstyrrelse i dagliglivet. Gastrointestinale sykdommer inkluderer magesmerter og ubehag, oppblåsthet, halsbrann, fordøyelsesbesvær eller dyspepsi, kvalme, oppkast, diaré og forstoppelse2. Diaré er det vanligste symptomet på GI-lidelse3, og det er definert som en sykdom med minst tre løs og vannaktig avføring i løpet av en 24 timers periode4. Diaré er forårsaket av et bredt spekter av patogener, inkludert bakterier, virus, parasitter, sopp, og kan også være forårsaket av narkotika 5,6. Over hele verden fortsetter diaré å være den nest største dødsårsaken blant barn under 5 år7. Selv om diaré kan løse seg selv, kan det også indikere en mer alvorlig underliggende tilstand hvis den varer i mer enn noen få dager.
For å studere tarmkanalen henvender forskerne seg til dyremodeller som mus, rotter og griser 8,9. Imidlertid kan bruken av disse dyrene være dyrt og tidkrevende fordi de krever spesialiserte fasiliteter og etiske hensyn. Nylige studier har vist at D. melanogaster kan brukes som en modell for å studere GI-kanalen og undersøke noen mekanismer som vedlikehold av regenerativ homeostase, utvikling av immun senescens, tap av epitelbarrierefunksjon og nedgangen i metabolsk homeostase10,11. D. melanogaster, kjent som bananfluen, deler en høy grad av genetisk homologi med mennesker; Omtrent 75% av menneskelige sykdomsgener antas å ha en funksjonell homolog i FLY12. De har også et enkelt fordøyelsessystem bestående av en foregut, en midgut og en hindgut13. D. melanogaster er lett å dyrke i laboratoriet og kan genmodifiseres på forskjellige måter14. Derfor er bruk av D. melanogaster for in vivo-testing et kraftig verktøy som gjør det mulig for forskere å studere komplekse biologiske prosesser i en kontrollert setting.
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) bruker ca 80% av mennesker som bor i utviklingsland tradisjonell medisin for deres primære helsebehov15. Den høye bruken av medisinplanter kan forklares med at de er lett tilgjengelige, billige og har få bivirkninger16. De viktigste plantedelene som brukes i urteterapi inkluderer blader, bark, røtter, frø17, mens de viktigste fremstillingsmetodene er infusjon, avkok og maserasjon18. Disse urtemedisinene inneholder fytokjemiske stoffer som alkaloider, terpenoider, flavonoider, steroider, tanniner og karbohydrater19, som har terapeutiske effekter på menneskekroppen. Folk bruker en rekke medisinske planter for å behandle GI-lidelser som diaré, magesmerter og dysenteri20. For eksempel er Psidium guajava en av de mest brukte plantene for å behandle diaré i verden. Ulike farmakologiske og kliniske tester har allerede vist sin sikkerhet, noe som gjør det til en god antidiarrheal kandidat til å studere21,22. Imidlertid er de største begrensningene til urtemedisiner mangelen på effektivitet og sikkerhetsvurdering, samt mangel på sikker og fullstendig informasjon om sammensetningen av planteekstrakter som brukes23. For å validere effektiviteten og sikkerheten til urtelegemidler er det nødvendig med en systematisk tilnærming som involverer eksperimentell og klinisk validering, og tilnærmingen bør støttes av nok data fra in vivo– og in vitro-studier.
For å evaluere tradisjonelle rettsmidler for deres effekt i behandlingen av diaré, har bruken av mus og rotter vært dominerende de siste tiårene24,25. På grunn av de viktigste fordelene nevnt tidligere, dvs. brukervennlighet, rimelig, replikerbar, konservert absorberende og fordøyelsesfunksjoner mellom fluer og pattedyr, foreslår vi å bruke D. melanogaster som en modell for å evaluere plantens antidiarrheal aktivitet. Den diaréfenotypen i D. melanogaster kan karakteriseres av flere funksjoner, inkludert økt overflod av fekale avsetninger, større innskuddsstørrelser, en lysere farge (mindre konsentrert) og høyere fekalmateriale26. Denne fenotypen kan kvantifiseres ved hjelp av forskjellige parametere: antall fekale avsetninger, totalt areal av avleiringer, gjennomsnittlig lyshet og total integrert optisk tetthet (IOD). Total IOD er definert som det totale fargeinnholdet i forekomsten, noe som betyr at det totale fekale materialet utskilles27. Tidligere har en analyse blitt utviklet for å analysere fekale forekomster av D. melanogaster27,28. I denne analysen ble den ultimate leseren av møkk (T.U.R.D.) brukt som et fekalanalyseverktøy, som gjør det mulig å sjekke antall, størrelse og lyshet av fekale forekomster og dermed overvåke tarmfysiologien til fruktfluene. Denne metoden ble imidlertid aldri brukt for å evaluere diaréfenotypen hos fluer. Ion Transport Peptide (ITP) -genet er en viktig endokrin regulator av tørst og utskillelse og kombinerer vannhomeostase med fôring i D. melanogaster. I en nylig studie ble det vist at hastigheten på mattransitt gjennom GI-kanalen og hyppigheten av avføringshendelser ble redusert av ITP-overuttrykk og økt ved ITP-knockdown. Sistnevnte fenotype ble beskrevet som diaréaktig av forfatterne av denne studien29.
I denne protokollen brukes en modifisert versjon av fekalinnskuddsanalysen for å vurdere effekten av et antidiarrheal middel (dvs. guavabladekstrakt) på mage-tarmkanalen til D. melanogaster ved å bruke ITPi-stammen som en diarémodell. Det overordnede målet med denne metoden er: 1) å gi en enkel og pålitelig metode for å evaluere antidiarrheal effekten av narkotika og planteekstrakter, og 2) å tillate oppdagelsen av bioaktive forbindelser som er ansvarlige for antidiarrheal effekten i planteekstrakter ved å anvende en bioaktivitetsstyrt tilnærming.
D. melanogaster har blitt allment akseptert som en modell for ulike biologiske prosesser på grunn av likheten i gener mellom D. melanogaster og mennesker36. Bruken av D. melanogaster som en modell for å studere tarmkanalen er utbredt, og anvendelsen av T.U.R.D. har blitt brukt til å estimere antall, areal og mengde fekale avsetninger. Den fenotypiske deteksjonsmetoden har imidlertid ikke blitt brukt til å vurdere diaré hos bananfluer. Derfor introduserer denne protokollen en ny metode for å grovt vurdere tilstedeværelsen av diaré ved å oppdage fekale forekomster.
Fekale innskudd er en viktig indikator på tarmkanalens funksjon og helse37. I denne sammenheng foreslås en metode for oppdrett av D. melanogaster på legemiddelholdig medium for å undersøke ulike parametere av fekale forekomster. Ved å overvåke antall innskudd, er det mulig å bestemme hyppigheten av avføring og vurdere om et stoff har noen innvirkning på tarmtransittrasjonen. Det totale arealet av innskuddene kan måles for å evaluere konsentrasjonen og fortynningen av avføring, noe som er en viktig faktor for å bestemme den generelle helsen til tarmkanalen. I tillegg kan den totale integrerte optiske tettheten (IOD) brukes til å oppdage den totale mengden fecal materiale som er tilstede i innskuddene. Denne protokollen gir en effektiv metode for å screene og evaluere medisiner samt planteekstrakter som påvirker tarmkanalen. Når D. melanogaster brukes som en modellorganisme, er det mulig å vurdere effekten av potensielle stoffer, noe som kan bidra til å akselerere stoffoppdagelsesprosessen. Ved å bruke denne metoden på planteekstrakter, kan forskere bidra til å validere bruken som antidiarrheal agenter.
Det er flere kritiske skritt å vurdere når du bruker denne protokollen til å studere fekale forekomster i D. melanogaster. For det første er det viktig å beregne massen som kreves for å oppnå ønsket konsentrasjon av legemidlet i mediet. Videre er det viktig å sikre god forberedelsestilstand når stoffet tilsettes til mediet, da høye temperaturer kan forringe stoffet og påvirke dets styrke. For det andre er utvelgelsen av hunnfluer viktig i denne protokollen. Det er viktig å bruke jomfruelige hunnfluer for å unngå forskjellene i avføring mellom jomfruelige og parrede hunner. For eksempel er flekkene produsert av jomfruhunner mer sirkulære enn parrede hunner, og parrede hunner har en tendens til å skille ut mer fekalt materiale enn jomfruhunner27,28. Derfor anbefales det å samle fluer før 8 timer med eclosion for å sikre at alle hunner som samles inn er jomfruer. I tillegg bør de testede fluene være sterke og sunne, da helsen deres kan påvirke matinntaket og fekal produksjon. For eksempel kan fluer som har en anormal form av vinger ha problemer med å få maten. Til slutt, for å bruke T.U.R.D. vellykket, er innstillingene for blokkstørrelse (piksler) og offset avgjørende. På grunn av forskjellen i lyskontrasten til bildene, kan det være nødvendig å prøve forskjellige innstillinger for å oppnå best mulig identifisering av fekale forekomster.
Selv om metoden som presenteres er effektiv, er det flere begrensninger. Den ene er nøyaktigheten av legemiddelkonsentrasjonen i mediet. Da mediet oppvarmes under tilberedningen, kan noe vann fordampe, noe som kan påvirke konsentrasjonen av legemidlet. En annen begrensning er skanningen av petriskålene. Noen deler av petriskålene (dvs. kanter) skannes ikke, og dette kan føre til en feilberegning av de totale fekale avsetningene. I tillegg produserer fluene ikke samme mengde fekale forekomster på topp- og bunndekslene på petriskålene. Fordi de har en tendens til å produsere flere innskudd på bunndekselet, kan standardavviket til analysen mellom topp- og bunndekselet være høyt, noe som kan påvirke nøyaktigheten av resultatene.
Ved hjelp av denne protokollen kan forskere studere diaré i D. melanogaster. Ved å modifisere det stoffholdige mediet, kan denne metoden brukes til å skjerme antidiarrheal planter, noe som gir en ny tilnærming til narkotikaforskning. Tradisjonell medisin og naturlige produkter har blitt brukt i århundrer for å behandle ulike sykdommer, inkludert gastrointestinale sykdommer. Ved å bruke denne protokollen for å evaluere effekten av planteekstrakter på fekale forekomster, kan potensielle nye behandlinger for tarmlidelser identifiseres og en vitenskapelig begrunnelse for deres bruk som antidiarrheal midler kan gis. Denne tilnærmingen kan gi et verdifullt bidrag til feltet narkotikaforskning og etnofarmakologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Martina Gáliková for å gi oss Drosophila-stammene . Vi er takknemlige for Michelle Crozatier-Borde og Marc Haenlin-teamet for å gi tilbakemelding på studien vår og hjelpe oss med å forbedre modellen vår. Vi takker Napo Pharmaceuticals Company for å ha gitt oss stoffet Crofelemer. Forfatterne er også takknemlige til gjesteredaktør Dr. Hugues Petitjean for å gi oss muligheten til å publisere denne protokollen. Denne studien ble finansiert av Agence Nationale de la Recherche (ANR) under prosjektet ANR-22-CE03-0001-01.
Chemical & Food medium | |||
Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
Crofelemer | Napo pharmaceuticals | – | – |
Ethanol 96% | – | – | – |
Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
Materials | |||
Beaker | DWK LIFE SCIENCE | – | 250 mL |
Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
CO2 tank | – | – | – |
Erlen Meyer flask | – | – | 500 mL (for extraction) |
Filter paper grade | Whatman | – | 3 mm chr. |
Flowbuddy socle | Genesis | – | – |
Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | – |
Flystuff Blow gun | Genesis | – | – |
Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | – | – |
Flystuff Foot pedal | Genesis | – | – |
Forceps | Dumostar | 11295-51 | – |
Graduated cylinder | – | – | 100 mL |
Inox spatula | – | – | – |
Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | – |
Paintbrush | – | – | – |
Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
Round-bottom flask | – | – | 500 mL (for evaporation) |
Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
Whisk | – | – | – |
Equipments | |||
Chiller | HUBER | Minichiller | – |
Heating bath | BÜCHI | B-490 | – |
Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | – | Magnetic stirrer hot plate |
Incubator | Memmert | – | HPP110eco |
Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | – |
Scanner | Epson | V850 pro | – |
Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | – |
Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | – |
Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | – |
Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | – |