Questo protocollo presenta un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello murino di osteoporosi combinando tecniche di colorazione ematossilina-eosina (HE) e micro-tomografia computerizzata (Micro-CT).
La microstruttura ossea si riferisce alla disposizione e alla qualità del tessuto osseo a livello microscopico. Comprendere la microstruttura ossea dello scheletro è fondamentale per comprendere la fisiopatologia dell’osteoporosi e migliorarne il trattamento. Tuttavia, la manipolazione di campioni ossei può essere complessa a causa delle loro proprietà dure e dense. In secondo luogo, il software specializzato rende difficile l’elaborazione e l’analisi delle immagini. In questo protocollo, presentiamo una soluzione economica e facile da usare per l’analisi della microstruttura ossea trabecolare. Vengono forniti passaggi e precauzioni dettagliati. La micro-CT è una tecnica di imaging tridimensionale (3D) non distruttiva che fornisce immagini ad alta risoluzione della struttura ossea trabecolare. Consente la valutazione obiettiva e quantitativa della qualità ossea, motivo per cui è ampiamente considerato il metodo gold standard per la valutazione della qualità ossea. Tuttavia, l’istomorfometria rimane indispensabile in quanto offre parametri cruciali a livello cellulare, colmando il divario tra le valutazioni bidimensionali (2D) e 3D dei campioni ossei. Per quanto riguarda le tecniche istologiche, abbiamo scelto di decalcificare il tessuto osseo per poi eseguire l’inclusione tradizionale della paraffina. In sintesi, la combinazione di questi due metodi può fornire informazioni più complete e accurate sulla microstruttura ossea.
L’osteoporosi è una malattia metabolica ossea prevalente, soprattutto tra gli anziani, ed è associata ad un aumentato rischio di fratture da fragilità. Man mano che l’osteoporosi diventa più comune in Cina1, ci sarà una crescente domanda per lo studio delle strutture ossee di piccoli animali 2,3. I metodi precedenti di misurazione della perdita ossea si basano sui risultati dell’assorbimetria bidimensionale a raggi X a doppia energia. Tuttavia, questo non cattura i cambiamenti nella microstruttura architettonica dell’osso trabecolare, che è un fattore chiave per la forza scheletrica4. La microstruttura dell’osso influisce sulla sua forza, rigidità e resistenza alla frattura. Confrontando la microarchitettura ossea in condizioni normali e patologiche, è possibile identificare i cambiamenti nella morfologia, nella struttura e nella funzione del tessuto osseo causati dall’osteoporosi. Queste informazioni contribuiscono alla comprensione dello sviluppo dell’osteoporosi e della sua associazione con altre malattie.
L’imaging con micro-tomografia computerizzata (Micro-CT) è recentemente diventato una tecnica popolare per la valutazione della morfologia ossea, in grado di fornire dati accurati e completi sulla struttura ossea e sui parametri di densità come la frazione di volume osseo, lo spessore e la separazione 5,6. Allo stesso tempo, i risultati della Micro-CT possono essere influenzati dal software di analisi7. Diversi metodi di acquisizione, valutazione e refertazione delle immagini sono utilizzati da vari sistemi Micro-CT commerciali. Questa incoerenza rende difficile confrontare e interpretare i risultati riportati da diversi studi5. Inoltre, attualmente non può sostituire l’istomorfometria ossea nel fornire ai ricercatori informazioni sui parametri a livello cellulare nel sistema scheletrico8. Nel frattempo, le tecniche istologiche consentono l’osservazione diretta e la misurazione della morfologia microscopica dell’osso. La colorazione con ematossilina ed eosina (HE) è una tecnica di colorazione comune utilizzata in istologia per visualizzare la struttura generale di cellule e tessuti. Viene utilizzato per identificare la presenza di tessuto osseo e la sua microarchitettura.
Questo articolo utilizza la Micro-CT combinata con la tecnica di taglio dei tessuti (colorazione ematossilina-eosina [HE]) per raccogliere immagini di tessuto osseo ed eseguire analisi quantitative dell’osso trabecolare per valutare i cambiamenti della microstruttura ossea in un modello murino di osteoporosi.
L’osteoporosi può portare a fratture frequenti, che sono costose, possono causare dolore, disabilità o addirittura la morte e compromettere seriamente la qualità della vita dei pazienti20. Nel corso degli anni, il modello di ovariectomia è stato riconosciuto come uno dei metodi standard per lo studio dell’osteoporosi21. Il modello animale preclinico più comune per l’osteoporosi è il ratto ovariectomizzato (OVX). Nonostante ciò, la maggior parte della ricerca sui mecc…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dall’Amministrazione provinciale di medicina tradizionale cinese del Sichuan (2021YJ0175) e dal Progetto di innovazione della ricerca universitaria della Scuola di medicina clinica (LCYJSKT2023-11), Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu.
4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |