Laser Capture Microdissection에 의한 구강 점막하 섬유증 샘플에서 형태학적 및 공간적 정보가 있는 세포 분리
Summary
구강 점막하 섬유증 조직의 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹스 데이터를 분석하기 위해 조직학적 관심 영역에서 세포를 정밀하게 추출할 수 있습니다.
Abstract
구강 점막하 섬유증(OSF)은 구강 내 악성 질환의 흔한 유형입니다. 상피의 위축과 lamina propria와 submucosa의 섬유화는 종종 조직 병리학적 슬라이드에서 발견됩니다. 상피 이형성증, 상피 위축 및 노화 섬유아세포는 OSF의 악성 변형과 관련이 있는 것으로 제안되었습니다. 그러나 악성종양 가능성이 있는 구강질환과 구강편평세포암의 이질성으로 인해 OSF에서 악성형질전환의 특정 분자 기전을 규명하는 것은 어려운 실정이다. 여기에서는 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 슬라이드에서 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 데이터 및 공간 정보를 전달하는 소수의 상피 또는 중간엽 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 현미경을 사용하여 미세(~500개 세포) 이형성 또는 위축성 상피 조직과 섬유성 상피하 조직을 정밀하게 캡처할 수 있습니다. 추출된 세포는 게놈 또는 전사체 염기서열 분석으로 평가하여 형태학적 및 공간 정보가 포함된 게놈 및 전사체 데이터를 획득할 수 있습니다. 이 접근법은 벌크 OSF 조직 염기서열 분석의 이질성과 병변이 없는 영역의 세포에 의해 발생하는 간섭을 제거하여 OSF 조직의 정확한 공간 오믹스 분석을 가능하게 합니다.
Introduction
구강 점막하 섬유증(Oral submucous fibrosis, OSF)은 주로 협측 점막에서 발생하여 입 벌림이 제한되는 만성 잠복성 질환이다1. OSF는 다인자성 질병이지만, 아레카 너트 또는 빈랑 씹는 것이 OSF 2,3의 주요 원인입니다. 이러한 지리적인 특성으로 인해 OSF는 주로 동남아시아와 남아시아의 인구에 집중되어 있다3. OSF의 일반적인 조직학적 특징으로는 구강 점막 상피 아래 결합 조직의 비정상적인 콜라겐 침착, 혈관 협착증 및 폐색이 있다1. OSF 상피 조직은 구강 백반증과 병행될 경우 위축 또는 증식증 및 이형성증의 징후를 나타낼 수 있습니다 4,5.
OSF는 세계보건기구(WHO)에 의해 4%-6%의 악성 변형률로 구강 편평 세포 암종으로 진행될 가능성이 있는 일반적인 구강 잠재적 악성 질환(OPMD)으로 정의됩니다6,7,8,9. OSF의 악성 변형의 기저에 있는 메커니즘은 복잡합니다10. 이형성증과 위축을 포함한 상피의 비정상적인 성장은 발암 가능성을 증가시키며, 기질의 노화 섬유아세포는 활성산소종(ROS) 및 기타 분자를 통해 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도하여 OSF의 악성 진행에 관여할 수 있다10.
공간-오믹 분석 기술은 암 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹 데이터를 생성했습니다11,12,13. 여기에서는 레이저 미세해부를 통해 포르말린 고정 파라핀이 포매된 OSF 조직에서 형태학 관련 세포 집단을 캡처하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 샘플의 다중 오믹 분석은 조직 내 이질성 문제를 극복하고 OSF14의 분자 병리학 및 악성 형질전환 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 레이저 미세해부를 통한 추가 공간 오믹 분석을 위해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 OSF 조직 샘플을 캡처하는 파이프라인을 보고했습니다. 대표 결과에서 다양한 형태학 관련 샘플에서 서로 다른 CNA 패턴을 확인했습니다.
OPMD의 일종인 OSF는 구강 편평 세포 암종의 흔한 전암성 상태이다6. 게놈 불안정성은 OPMD17,18<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81671006, 81300894), CAMS 의학 혁신 기금 (2019-I2M-5-038), 국가 임상 핵심 분야 구축 프로젝트 (PKUSSNKP-202102), 베이징 대학 건강 과학 센터 우수 박사 후보자 혁신 기금 (BMU2022BSS001)의 연구 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
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