Isolering av celler med morfologisk och rumslig information från orala submukösa fibrosprover genom laserfångstmikrodissektion
Summary
Laserinfångande mikrodissektion av orala submukösa fibrosvävnader möjliggör exakt extraktion av celler från histologiska regioner av intresse för analys av multi-omics-data med morfologisk och rumslig information.
Abstract
Oral submukös fibros (OSF) är en vanlig typ av potentiellt malign sjukdom i munhålan. Atrofi av epitel och fibros av lamina propria och submucosa finns ofta på histopatologiska objektglas. Epitelial dysplasi, epitelial atrofi och senescenta fibroblaster har föreslagits vara associerade med den maligna omvandlingen av OSF. På grund av heterogeniteten hos potentiellt maligna orala sjukdomar och orala skivepitelcancer är det dock svårt att identifiera de specifika molekylära mekanismerna för malign transformation vid OSF. Här presenterar vi en metod för att erhålla ett litet antal epitelceller eller mesenkymala celler som bär morfologiska data och rumslig information genom laserinfångning av mikrodissektion på formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsglas. Med hjälp av ett mikroskop kan vi exakt fånga dysplastisk eller atrofisk epitelvävnad i mikroskala (~500 celler) och fibrotisk subepitelvävnad. De extraherade cellerna kan utvärderas genom genom- eller transkriptomsekvensering för att samla in genomiska och transkriptomiska data med morfologisk och rumslig information. Detta tillvägagångssätt tar bort heterogeniteten hos bulksekvensering av OSF-vävnad och den interferens som orsakas av celler i icke-lesionerade områden, vilket möjliggör exakt rumslig omics-analys av OSF-vävnad.
Introduction
Oral submukös fibros (OSF) är en kronisk, lömsk sjukdom som utvecklas främst i munslemhinnan och resulterar i begränsad munöppning1. Medan OSF är en multifaktoriell sjukdom, är tuggning av arekanötter eller betelnötter den främsta orsaken till OSF 2,3. På grund av denna geografiskt specifika vana är OSF främst koncentrerad till populationer iSydost- och Sydasien3. De vanliga histologiska kännetecknen för OSF inkluderar onormal kollagenavlagring i bindväven under munslemhinneepitelet, vaskulär stenos och ocklusion1. OSF-epitelvävnad kan uppvisa manifestationer av atrofi eller hyperplasi och till och med dysplasi vid samtidig behandling med oral leukoplaki 4,5.
OSF definieras av Världshälsoorganisationen som en vanlig oral potentiellt malign sjukdom (OPMD) som uppvisar potential att utvecklas till oral skivepitelcancer med en malign transformationshastighet på 4%-6%6%6,7,8,9. Mekanismen bakom den maligna omvandlingen av OSF är komplex10. Onormal tillväxt av epitelet, inklusive både dysplasi och atrofi, ökar risken för karcinogenes, och senescenta fibroblaster i stromat kan vara involverade i den maligna progressionen av OSF genom att inducera epitelial-mesenkymal övergång (EMT) genom reaktiva syrearter (ROS) och andra molekyler10.
Tekniker för rumsliga analyser genererade multi-omiska data med morfologisk och rumslig information som har gett insikter i cancermekanismer11,12,13. Här presenterar vi ett protokoll för att fånga morfologirelaterade cellpopulationer från formalinfixerad paraffininbäddad OSF-vävnad genom lasermikrodissektion. Multi-omiska analyser av dessa prover kan övervinna utmaningar med intravävnadsheterogenitet och öka förståelsen för den molekylära patologin och mekanismerna för malign transformation i OSF14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll rapporterade en pipeline för att fånga OSF-vävnadsprover med morfologisk och rumslig information för ytterligare rumsliga analyser genom lasermikrodissektion. Från de representativa resultaten identifierade vi olika CNA-mönster bland olika morfologirelaterade prover.
OSF, en typ av OPMD, är ett vanligt precanceröst tillstånd av oral skivepitelcancer6. Genomisk instabilitet har rapporterats vara associerad med utveckling och malign transformation…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av forskningsanslag från National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
