Optimierung der Epithelzellkultur der Maus-Primärlinse: Ein umfassender Leitfaden zur Trypsinisierung
Summary
Dieses Manuskript skizziert ein detailliertes Videoprotokoll für die Kultivierung von primären Linsenepithelzellen (LECs), das darauf abzielt, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Forschung bei Katarakten und hinterer Kapseltrübung (PCO) zu unterstützen. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Linsendissektion, LECs-Isolierung und Validierung und dient insbesondere für Neueinsteiger auf diesem Gebiet als wertvoller Leitfaden.
Abstract
Linsenepithelzellen (LECs) spielen mehrere wichtige Rollen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion der Linse. LECs bestimmen das Wachstum, die Entwicklung, die Größe und die Transparenz von Linsen. Umgekehrt können dysfunktionale LECs zur Kataraktbildung und zur Trübung der hinteren Kapsel (PCO) führen. Daher ist die Etablierung eines robusten primären LEC-Kultursystems für Forscher wichtig, die sich mit Linsenentwicklung, Biochemie, Katarakttherapeutika und PCO-Prävention befassen. Der Anbau von primären LECs stellt jedoch aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit, langsamen Proliferationsrate und empfindlichen Natur seit langem eine Herausforderung dar.
Diese Studie befasst sich mit diesen Hürden, indem sie ein umfassendes Protokoll für die primäre LEC-Kultur vorstellt. Das Protokoll umfasst wesentliche Schritte wie die Formulierung eines optimierten Nährmediums, die präzise Isolierung von Linsenkapseln, Trypsinisierungstechniken, Subkulturverfahren, Ernteprotokolle sowie Richtlinien für Lagerung und Versand. Während des gesamten Kulturprozesses wurde die Zellmorphologie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht.
Um die Authentizität der kultivierten LECs zu bestätigen, wurden Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt, um das Vorhandensein und die subzelluläre Verteilung kritischer Linsenproteine, nämlich αA- und γ-Kristalline, nachzuweisen. Dieses detaillierte Protokoll stattet Forscher mit einer wertvollen Ressource für die Kultivierung und Charakterisierung primärer LECs aus und ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der Linsenbiologie und der Entwicklung therapeutischer Strategien für linsenbedingte Erkrankungen.
Introduction
Die Augenlinse spielt eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie das einfallende Licht auf die Netzhaut fokussiert. Es besteht aus einer transparenten, avaskulären Struktur, die aus spezialisierten Zellen besteht, unter denen Linsenepithelzellen (LECs) eine Schlüsselrolle spielen. LECs befinden sich an der vorderen Oberfläche der Linse und sind für die Aufrechterhaltung ihrer Transparenz, die Regulierung des Wasserhaushalts und die Teilnahme am Wachstum und der Entwicklung der Linseverantwortlich 1,2. LECs sind eine einzigartige Art von Zellen, die sich im vorderen Teil der Linse befinden und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit und Funktion der Linse spielen, indem sie während des gesamten Lebens kontinuierlich Linsenfasern produzieren.
Katarakte sind durch eine fortschreitende Trübung der Linse gekennzeichnet, die zu einer Verzerrung und Streuung des Lichts führt, was zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens führt 3,4. Die genauen Mechanismen, die der Kataraktbildung zugrunde liegen, sind komplex und multifaktoriell und umfassen verschiedene zelluläre und molekulare Prozesse wie UV-Strahlung, oxidative Schäden und Glykation 5,6. Es wurde festgestellt, dass LECs erheblich zur Entwicklung von Katarakten beitragen, was sie zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt macht 1,2,7,8,9.
Darüber hinaus ist eines der drängendsten Probleme in der heutigen Augenheilkunde die relativ hohe Inzidenz der hinteren Kapseltrübung (PCO), auch bekannt als sekundärer Katarakt. PCO ist nach wie vor die häufigste Komplikation nach Kataraktoperationen und betrifft bis zu 20-40% der erwachsenen Patienten und 100% der Kinder innerhalb von 5 Jahren nach der Operation10. PCO wird hauptsächlich durch die verbleibenden LECs verursacht, die nach der Kataraktextraktion im Kapselsack verbleiben. Diese Zellen durchlaufen eine facettenreiche pathophysiologische Transformation, die nicht nur den Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT), sondern auch die Differenzierung von LECs zu Linsenfasern umfasst, was zu einer Zellpopulation führt, die eine Mischung aus LECs, Fasern und Myofibroblasten ist 11,12,13. Die transformierten Zellen vermehren sich und wandern durch die hintere Linsenkapsel, was zu Sehstörungen führt. Das Verständnis des Verhaltens und der Kontrollmechanismen von LECs in Kulturmodellen kann wertvolle Einblicke in die Prävention und das Management von PCO liefern. Daher stellt dieses Protokoll zur Kultivierung von LECs ein wichtiges Werkzeug für Augenforscher dar, die darauf abzielen, diese weit verbreitete postoperative Komplikation zu untersuchen, zu verstehen und letztendlich zu bekämpfen.
Um die Feinheiten der LEC-Biologie und ihre Rolle bei der Kataraktbildung und PCO zu entschlüsseln, ist es wichtig, robuste und reproduzierbare In-vitro-Primärzellkultursysteme zu etablieren. Die primäre LEC-Kultur bietet Forschern eine kontrollierte Umgebung, um die Funktionen, Signalwege und molekularen Eigenschaften von LECs zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung zellulärer Prozesse und der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen und liefert wertvolle Einblicke in die Linsenphysiologie und -pathologie.
Frühere Forschungen haben unser Verständnis der LEC-Kulturtechniken bereichert 14,15,16,17,18,19,20. Obwohl diese Studien verschiedene Methoden angewendet und signifikante Erkenntnisse über das Verhalten und die Eigenschaften von LECs geliefert haben, fehlt in der aktuellen Literatur ein umfassendes und zugängliches Videoaufzeichnungsprotokoll für die Kultivierung von LECs. Diese Einschränkung kann die Fähigkeit von Anfängern behindern, die Techniken genau zu reproduzieren, und kann zu Inkonsistenzen und Abweichungen in den experimentellen Ergebnissen führen. Durch die Bereitstellung eines Videoaufzeichnungsprotokolls zielt diese Forschungsarbeit darauf ab, diese Lücke zu schließen und eine standardisierte Ressource bereitzustellen, die die Reproduzierbarkeit verbessern und den Wissenstransfer im Bereich der LEC-Kultur erleichtern kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung für die erfolgreiche Isolierung, Kultur und Subkultur von primären LECs, komplett mit begleitender Videodokumentation. Der detaillierte visuelle Leitfaden neben den schriftlichen Anweisungen verbessert die Klarheit und Zugänglichkeit des Protokolls und fördert seine Verwendung und Reproduzierbarkeit bei Forschern auf diesem Gebiet. Das ultimative Ziel ist es, zum wachsenden Wissen über die Rolle von LECs bei der Katar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von NEI R21EY033941 (an Hongli Wu); W81XWH2010896 des Verteidigungsministeriums (an Hongli Wu); R15GM123463-02 (für Kayla Green und Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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