Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l’obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull’opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l’isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.
Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) svolgono molteplici ruoli importanti nel mantenimento dell’omeostasi e della normale funzione del cristallino. I LEC determinano la crescita, lo sviluppo, le dimensioni e la trasparenza delle lenti. Al contrario, i LEC disfunzionali possono portare alla formazione della cataratta e all’opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Di conseguenza, la creazione di un solido sistema di coltura LEC primario è importante per i ricercatori impegnati nello sviluppo di lenti, nella biochimica, nelle terapie della cataratta e nella prevenzione della PCO. Tuttavia, la coltivazione di LEC primari ha presentato a lungo sfide a causa della loro disponibilità limitata, del lento tasso di proliferazione e della natura delicata.
Questo studio affronta questi ostacoli presentando un protocollo completo per la coltura LEC primaria. Il protocollo comprende fasi essenziali come la formulazione di un terreno di coltura ottimizzato, l’isolamento preciso delle capsule di lenti, le tecniche di tripsinizzazione, le procedure di sottocoltura, i protocolli di raccolta e le linee guida per lo stoccaggio e la spedizione. Durante tutto il processo di coltura, la morfologia cellulare è stata monitorata utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
Per confermare l’autenticità dei LEC in coltura, sono stati condotti saggi di immunofluorescenza per rilevare la presenza e la distribuzione subcellulare di proteine lente critiche, vale a dire αA- e γ-cristalline. Questo protocollo dettagliato fornisce ai ricercatori una risorsa preziosa per coltivare e caratterizzare i LEC primari, consentendo progressi nella nostra comprensione della biologia del cristallino e nello sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi correlati al cristallino.
Il cristallino dell’occhio svolge un ruolo cruciale nella visione focalizzando la luce in entrata sulla retina. È costituito da una struttura trasparente e avascolare composta da cellule specializzate, tra le quali le cellule epiteliali del cristallino (LEC) sono protagoniste. I LEC si trovano sulla superficie anteriore del cristallino e sono responsabili del mantenimento della sua trasparenza, della regolazione dell’equilibrio idrico e della partecipazione alla crescita e allo sviluppo del cristallino 1,2. I LEC sono un tipo unico di cellule situate nella parte anteriore del cristallino, che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della chiarezza e della funzione del cristallino producendo continuamente fibre del cristallino per tutta la vita.
La cataratta è caratterizzata dal progressivo offuscamento del cristallino, con conseguente distorsione e dispersione della luce, che porta a una visione compromessa 3,4. I meccanismi precisi alla base della formazione della cataratta sono complessi e multifattoriali, coinvolgendo vari processi cellulari e molecolari come la radiazione UV, il danno ossidativo e la glicazione 5,6. È stato riscontrato che i LEC contribuiscono in modo significativo allo sviluppo della cataratta, rendendoli un obiettivo vitale della ricerca 1,2,7,8,9.
Inoltre, uno dei problemi più urgenti in oftalmologia oggi è l’incidenza relativamente elevata di opacizzazione della capsula posteriore (PCO), nota anche come cataratta secondaria. La PCO rimane la complicanza più comune dopo l’intervento di cataratta, colpendo fino al 20-40% dei pazienti adulti e il 100% dei bambini entro 5 anni dall’intervento chirurgico10. La PCO è causata principalmente dai LEC residui che rimangono nel sacco capsulare dopo l’estrazione della cataratta. Queste cellule subiscono una trasformazione fisiopatologica multiforme che coinvolge non solo la transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT), ma anche la differenziazione dei LEC in fibre del cristallino, risultando in una popolazione cellulare che è una miscela di LEC, fibre e miofibroblasti 11,12,13. Le cellule trasformate proliferano e migrano attraverso la capsula posteriore del cristallino, portando a una compromissione della vista. La comprensione del comportamento e dei meccanismi di controllo dei LEC nei modelli di coltura può fornire preziose informazioni sulla prevenzione e la gestione della PCO. Pertanto, questo protocollo di coltura dei LEC rappresenta uno strumento vitale per i ricercatori oftalmici che mirano a studiare, comprendere e, infine, combattere questa complicanza postoperatoria prevalente.
Per svelare le complessità della biologia LEC e il suo ruolo nella formazione della cataratta e della PCO, è essenziale stabilire sistemi di coltura cellulare primaria in vitro robusti e riproducibili. La coltura primaria di LEC fornisce ai ricercatori un ambiente controllato per studiare le funzioni, la segnalazione e le caratteristiche molecolari dei LEC. Inoltre, consente di studiare i processi cellulari e gli effetti di diverse condizioni sperimentali, fornendo preziose informazioni sulla fisiologia e sulla patologia del cristallino.
Ricerche precedenti hanno arricchito la nostra comprensione delle tecniche di coltura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Sebbene questi studi abbiano impiegato varie metodologie e prodotto risultati significativi sul comportamento e sulle caratteristiche dei LEC, un protocollo di registrazione video completo e accessibile per la coltura dei LEC è assente nella letteratura attuale. Questa limitazione può ostacolare la capacità dei ricercatori alle prime armi di riprodurre accuratamente le tecniche e può portare a incongruenze e variazioni nei risultati sperimentali. Fornendo un protocollo di registrazione video, questo documento di ricerca mira a colmare questa lacuna e a fornire una risorsa standardizzata in grado di migliorare la riproducibilità e facilitare il trasferimento di conoscenze nel campo della cultura LEC.
Il protocollo presentato in questo documento fornisce una guida completa e dettagliata per il successo dell’isolamento, della cultura e della sottocultura dei LEC primari, completa di documentazione video di accompagnamento. La guida visiva dettagliata, insieme alle istruzioni scritte, migliora la chiarezza e l’accessibilità del protocollo, promuovendone l’uso e la riproducibilità tra i ricercatori del settore. L’obiettivo finale è quello di contribuire all’espansione delle conoscenze che circondano il ruolo dei LEC n…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Dipartimento della Difesa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green e Hongli Wu)
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |