В этой рукописи описывается подробный видеопротокол культивирования первичных эпителиальных клеток хрусталика (LEC), направленный на улучшение воспроизводимости и помощь в исследованиях катаракты и помутнения задней капсулы (ПКЯ). Он предлагает пошаговые инструкции по препарированию хрусталика, изоляции и валидации LEC, что служит ценным руководством, особенно для новичков в этой области.
Эпителиальные клетки хрусталика (LEC) играют несколько важных ролей в поддержании гомеостаза и нормального функционирования хрусталика. LEC определяют рост, развитие, размер и прозрачность хрусталика. И наоборот, дисфункциональные ЛЭК могут привести к образованию катаракты и помутнению задней капсулы (ПКЯ). Следовательно, создание надежной системы первичного культивирования LEC важно для исследователей, занимающихся разработкой хрусталиков, биохимией, терапией катаракты и профилактикой ПКЯ. Тем не менее, культивирование первичных ЛЭК уже давно представляет собой проблему из-за их ограниченной доступности, медленной скорости распространения и деликатного характера.
Данное исследование направлено на устранение этих препятствий путем представления комплексного протокола для первичной культуры LEC. Протокол включает в себя такие важные этапы, как разработка оптимизированной питательной среды, точная изоляция капсул хрусталика, методы трипсинизации, процедуры субкультуры, протоколы сбора урожая и рекомендации по хранению и транспортировке. На протяжении всего процесса культивирования морфологию клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Для подтверждения подлинности культивируемых ЛЭК были проведены иммунофлуоресцентные анализы для выявления наличия и субклеточного распределения критических белков хрусталика, а именно αA- и γ-кристаллинов. Этот подробный протокол предоставляет исследователям ценный ресурс для культивирования и характеристики первичных ЛЭК, что позволяет продвинуться в понимании биологии хрусталика и разработке терапевтических стратегий для расстройств, связанных с хрусталиком.
Хрусталик глаза играет решающую роль в зрении, фокусируя входящий свет на сетчатке. Он состоит из прозрачной аваскулярной структуры, состоящей из специализированных клеток, среди которых ключевыми игроками являются эпителиальные клетки хрусталика (LEC). ЛЭК располагаются на передней поверхности хрусталика и отвечают за поддержание его прозрачности, регулирование водного баланса и участие в росте и развитии хрусталика 1,2. LEC — это уникальный тип клеток, расположенных в передней части хрусталика, играющих важнейшую роль в поддержании четкости и функции хрусталика путем непрерывного производства волокон хрусталика на протяжении всей жизни.
Катаракта характеризуется прогрессирующим помутнением хрусталика, что приводит к искажению и рассеянию света, что приводит к ухудшению зрения 3,4. Точные механизмы, лежащие в основе образования катаракты, сложны и многофакторны, включая различные клеточные и молекулярные процессы, такие как ультрафиолетовое излучение, окислительное повреждение и гликирование 5,6. Было обнаружено, что LEC вносят значительный вклад в развитие катаракты, что делает их жизненно важным объектом исследований 1,2,7,8,9.
Кроме того, одной из наиболее актуальных проблем в офтальмологии на сегодняшний день является относительно высокая частота помутнения задней капсулы (СПКЯ), также известной как вторичная катаракта. ПКЯ остается наиболее распространенным осложнением после операции по удалению катаракты, поражая до 20-40% взрослых пациентов и 100% детей в течение 5 лет после операции10. ПКЯ в первую очередь вызывается остаточными ЛЭК, которые остаются в капсульном мешке после экстракции катаракты. Эти клетки претерпевают многогранную патофизиологическую трансформацию, включающую не только эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), но и дифференцировку ЛЭК в волокна хрусталика, в результате чего образуется клеточная популяция, представляющая собой смесь ЛЭК, волокон и миофибробластов 11,12,13. Трансформированные клетки пролиферируют и мигрируют через заднюю капсулу хрусталика, что приводит к ухудшению зрения. Понимание поведения и механизмов контроля LEC в культуральных моделях может дать ценную информацию о профилактике и лечении ПКЯ. Таким образом, этот протокол культивирования LEC представляет собой жизненно важный инструмент для офтальмологических исследователей, стремящихся изучить, понять и, в конечном счете, бороться с этим распространенным послеоперационным осложнением.
Чтобы разобраться в хитросплетениях биологии LEC и ее роли в формировании катаракты и ПКЯ, необходимо создать надежные и воспроизводимые системы первичных клеточных культур in vitro . Первичная культура LEC предоставляет исследователям контролируемую среду для изучения функций, сигнализации и молекулярных характеристик LEC. Кроме того, он позволяет исследовать клеточные процессы и эффекты различных экспериментальных условий, предоставляя ценную информацию о физиологии и патологии хрусталика.
Предыдущие исследования обогатили наше понимание методов культивирования LEC 14,15,16,17,18,19,20. Несмотря на то, что в этих исследованиях использовались различные методологии и были получены важные результаты о поведении и характеристиках LEC, в современной литературе отсутствует всеобъемлющий и доступный протокол видеозаписи для культивирования LEC. Это ограничение может препятствовать способности начинающих исследователей точно воспроизводить методы и может привести к несоответствиям и вариациям в экспериментальных результатах. Предоставляя протокол видеозаписи, данная исследовательская работа направлена на то, чтобы восполнить этот пробел и предоставить стандартизированный ресурс, который может повысить воспроизводимость и облегчить передачу знаний в области культуры LEC.
Протокол, представленный в этом документе, представляет собой всеобъемлющее, пошаговое руководство по успешной изоляции, культуре и субкультуре первичных LEC, дополненное сопроводительной видеодокументацией. Подробное визуальное руководство вместе с письменными инструкциями повыша?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NEI R21EY033941 (Hongli Wu); Министерство обороны W81XWH2010896 (Хунли Ву); R15GM123463-02 (Кайле Грин и Хунли Ву)
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |