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Neurosciences

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Abstract

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine wichtige physiologische Komponente des zentralen Nervensystems (ZNS), die Nährstoffe aufrechterhält, Abfallstoffe beseitigt und das Gehirn vor Krankheitserregern schützt. Die inhärenten Barriereeigenschaften der BHS stellen eine Herausforderung für die therapeutische Wirkstoffabgabe in das ZNS zur Behandlung neurologischer Erkrankungen dar. Eine beeinträchtigte BHS-Funktion wurde mit neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA), die Ablagerung von Amyloid im zerebralen Gefäßsystem, die zu einer beeinträchtigten BHS führt, ist in den meisten Fällen der Alzheimer-Krankheit (AD) eine Komorbidität, was darauf hindeutet, dass eine BHS-Dysfunktion oder ein BHS-Abbau an der Neurodegeneration beteiligt sein kann. Aufgrund des begrenzten Zugangs zu menschlichem BHS-Gewebe sind die Mechanismen, die zur ordnungsgemäßen Funktion der BHS und zur Degeneration der BHS beitragen, noch unbekannt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine humane pluripotente Stammzell-abgeleitete BHS (iBBB) entwickelt, indem wir Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten in eine 3D-Matrix integrieren. Die iBBB baut sich selbst zusammen, um die Anatomie und die zellulären Interaktionen in der BHS zu rekapitulieren. Die Aussaat von iBBBs mit Amyloid erfasst wichtige Aspekte von CAA. Darüber hinaus bietet das iBBB eine flexible Plattform zur Modulation genetischer und umweltbedingter Faktoren, die an zerebrovaskulären Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sind, um zu untersuchen, wie Genetik und Lebensstil das Krankheitsrisiko beeinflussen. Schließlich kann der iBBB für Arzneimittel-Screenings und medizinisch-chemische Studien verwendet werden, um die therapeutische Abgabe an das ZNS zu optimieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Differenzierung der drei Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten), die aus humanen pluripotenten Stammzellen entstehen, wie die differenzierten Zellen in die iBBB eingebaut werden und wie CAA in vitro mit exogenem Amyloid modelliert werden kann. Dieses Modell überwindet die Herausforderung, lebendes menschliches Hirngewebe mit einem System zu untersuchen, das sowohl biologische Genauigkeit als auch experimentelle Flexibilität aufweist und die Untersuchung der menschlichen BHS und ihrer Rolle bei der Neurodegeneration ermöglicht.

Introduction

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein wichtiges mikrovaskuläres Netzwerk, das das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Peripherie trennt, um eine ideale Umgebung für die ordnungsgemäße neuronale Funktion aufrechtzuerhalten. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Ein- und Ausflusses von Substanzen in das ZNS, indem es die metabolische Homöostase aufrechterhält 1,2,3,4, Abfallstoffe beseitigt 4,5,6 und das Gehirn vor Krankheitserregern und Toxinen schützt 7,8.

Der primäre Zelltyp der BHS ist die Endothelzelle (EC). Endothelzellen, die aus der Mesodermlinie stammen, bilden die Wände des Gefäßsystems 1,9. Mikrovaskuläre ECs bilden Tight Junctions miteinander, um die Permeabilität ihrer Membran stark zu verringern 10,11,12,13,14 während sie Transporter exprimieren, um den Transport von Nährstoffen in und aus dem ZNS zu erleichtern 1,4,12,14 . Mikrovaskuläre ECs sind von Perizyten (PCs) umgeben, die die mikrovaskuläre Funktion und Homöostase regulieren und für die Regulierung der Permeabilität der BHS für Moleküle und Immunzellen entscheidend sind 15,16,17. Der Astrozyt, ein wichtiger Gliazelltyp, ist der letzte Zelltyp, aus dem die BHS besteht. Die Endfüße der Astrozyten wickeln sich um die EC-PC-Gefäßröhren, während sich die Zellkörper in das Hirnparenchym erstrecken und eine Verbindung zwischen Neuronen und Gefäßen bilden1. Unterschiedliche Stoff- und Substrattransporter sind auf den Endfüßen der Astrozyten lokalisiert (z. B. Aquaporin 4 [AQP-4]), die eine entscheidende Rolle bei der BHS-Funktion spielen 18,19,20,21.

Die BHS ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Gehirngesundheit, und Funktionsstörungen der BHS wurden bei vielen neurologischen Erkrankungen berichtet, darunter Alzheimer-Krankheit (AD)22,23,24,25, Multiple Sklerose 7,26,27,28, Epilepsie29,30 und Schlaganfall31,32. Es wird zunehmend anerkannt, dass zerebrovaskuläre Anomalien eine zentrale Rolle bei der Neurodegeneration spielen und zu einer erhöhten Anfälligkeit für ischämische und hämorrhagische Ereignisse beitragen. Zum Beispiel leiden mehr als 90 % der Alzheimer-Patienten an zerebraler Amyloid-Angiopathie (CAA), einer Erkrankung, die durch die Ablagerung von Amyloid-β (Aβ) entlang des zerebralen Gefäßsystems gekennzeichnet ist. CAA erhöht die BHS-Permeabilität und verringert die BHS-Funktion, wodurch das ZNS anfällig für Ischämie, hämorrhagische Ereignisse und beschleunigten kognitiven Verfall wird33.

Wir haben kürzlich ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS entwickelt, das aus patienteninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wird und ECs, PCs und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind (Abbildung 1A). Die iBBB rekapituliert physiologisch relevante Interaktionen, einschließlich der Gefäßtubenbildung und der Lokalisation von Astrozyten-Endfüßen mit dem Gefäßsystem24. Wir haben die iBBB angewendet, um die Suszeptibilität von CAA zu modellieren, die durch APOE4 vermittelt wird (Abbildung 1B). Dies ermöglichte es uns, die kausalen zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, durch die APOE4 CAA fördert, und diese Erkenntnisse zu nutzen, um therapeutische Strategien zu entwickeln, die die CAA-Pathologie reduzieren und das Lernen und Gedächtnis in vivo in APOE4-Mäusen verbessern24. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll und ein Video-Tutorial zur Verfügung, um die BHS aus humanen iPS-Zellen zu rekonstruieren und CAA in vitro zu modellieren.

Protocol

1. Differenzierung von iPS-Zellen zu iBBB-Zellen ANMERKUNG: Diese Differenzierungsprotokolle wurden bereits in Mesentier-Louro et al.34 beschrieben. Beschichtung von ZellkulturplattenMembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor (GF) über Nacht bei 4 °C auftauen. Verdünnen Sie 500 μl Basalmembranmatrix in 49,5 ml DMEM. Halten Sie diese Lösung kalt, um eine vorzeitige Polymerisation der Beschichtungslösung zu verhindern. <…

Representative Results

Eine richtig geformte iBBB erstarrt zu einer einzigen durchscheinenden Scheibe (Abbildung 3A). Es ist normal, dass sich die iBBB nach einigen Tagen von der Oberfläche löst, auf die sie zuerst pipettiert wurde. Dies lässt sich nicht vermeiden, ist aber kein großes Problem für die ordnungsgemäße Bildung der iBBB, wenn beim Medienwechsel darauf geachtet wird, dass die iBBB nicht versehentlich abgesaugt wird. Nach 24 h können gleichmäßig verteilte, einzelne Zellen unter dem Hellfeldmik…

Discussion

Die BHS-Dysfunktion ist eine Komorbidität und möglicherweise eine Ursache oder ein verschlimmernder Faktor bei zahlreichen neurologischen Erkrankungen 7,40,41. Es ist jedoch nahezu unmöglich, die Molekular- und Zellbiologie zu untersuchen, die der Dysfunktion und dem Zusammenbruch der BHS bei Menschen mit neurovaskulären Erkrankungen zugrunde liegt. Die in diesem Protokoll vorgestellte induzierbare BHS (iBBB) bietet ein …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt von NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation und Brain Injury Association of America. C.G. wird von NIH F31NS130909 unterstützt. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
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References

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Keywords: Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy
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Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
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