Hybridisierung Kettenreaktion RNA Whole-Mount Fluoreszenz in situ Hybridisierung von chemosensorischen Genen in Riechanhängen von Mücken
Summary
Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.
Abstract
Stechmücken sind effektive Überträger tödlicher Krankheiten und können sich mit Hilfe von chemosensorischen Rezeptoren, die in ihren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, in ihrer chemischen Umgebung zurechtfinden. Das Verständnis, wie chemosensorische Rezeptoren in den peripheren olfaktorischen Anhängseln räumlich organisiert sind, kann Einblicke in die Kodierung von Gerüchen im Riechsystem von Mücken geben und neue Wege zur Bekämpfung der Ausbreitung von durch Mücken übertragenen Krankheiten aufzeigen. Das Aufkommen der dritten Generation der Hybridisierungskettenreaktions-RNA-Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) ermöglicht die räumliche Kartierung und gleichzeitige Erstellung von Expressionsprofilen mehrerer chemosensorischer Gene. Hier beschreiben wir einen schrittweisen Ansatz zur Durchführung von HCR-RNA-WM-FISH an der Anopheles-Moskitoantenne und dem Oberkieferpalp. Wir untersuchten die Sensitivität dieser Technik, indem wir das Expressionsprofil ionotroper olfaktorischer Rezeptoren untersuchten. Wir fragten, ob die beschriebene HCR WM-FISH-Technik für Multiplex-Studien geeignet ist, bei denen RNA-Sonden an drei spektral unterschiedliche Fluorophore gebunden werden. Die Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass HCR-RNA WM-FISH robust sensitiv ist, um mehrere chemosensorische Gene gleichzeitig in den olfaktorischen Anhängseln der Antenne und des Oberkiefers zu detektieren. Weitere Untersuchungen belegen die Eignung von HCR WM-FISH für das Co-Expressions-Profiling von Doppel- und Dreifach-RNA-Targets. Diese Technik könnte, wenn sie mit Modifikationen angewendet wird, anpassungsfähig sein, um Gene von Interesse im Riechgewebe anderer Insektenarten oder in anderen Anhängseln zu lokalisieren.
Introduction
Stechmückenvektoren wie Anopheles gambiae sind auf ein reiches Repertoire an chemosensorischen Genen angewiesen, die in ihren peripheren olfaktorischen Anhängseln exprimiert werden, um in einer komplexen chemischen Welt zu gedeihen und verhaltensrelevante Gerüche zu identifizieren, die von menschlichen Wirten ausgehen, Nektarquellen aufzuspüren und Eiablageplätze zu lokalisieren1. Die Mückenantenne und der Oberkieferpalp sind mit chemosensorischen Genen angereichert, die die Geruchswahrnehmung in diesen olfaktorischen Anhängseln steuern. Drei Hauptklassen von ligandengesteuerten Ionenkanälen steuern die Geruchserkennung in den olfaktorischen Anhängseln von Mücken: die Geruchsrezeptoren (ORs), die mit einem obligaten Geruchsrezeptor-Co-Rezeptor (Orco) zusammenarbeiten; die ionotropen Rezeptoren (IRs), die mit einem oder mehreren IR-Corezeptoren (IR8a, IR25a und IR76b) interagieren; die chemosensorischen gustatorischen Rezeptoren (GRs), die als Komplex aus drei Proteinen zum Nachweis von Kohlendioxid (CO2)1,2 fungieren.
Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis der Expression endogener mRNA3. Im Allgemeinen verwendet diese Methode eine Fluorophor-markierte einzelsträngige Nukleinsäuresonde mit einer Sequenz, die komplementär zu einer Ziel-mRNA ist. Die Bindung der fluoreszierenden RNA-Sonde an die Ziel-RNA ermöglicht die Identifizierung von Zellen, die ein Transkript von Interesse exprimieren. Jüngste Fortschritte ermöglichen nun die Detektion von Transkripten in ganzem Mückengewebe 4,5. Die erste Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR)-Technologie verwendete einen RNA-basierten HCR-Verstärker; Dies wurde in einer Methode der zweiten Generation verbessert, die stattdessen technisch hergestellte DNA für den HCR-Verstärker 6,7 verwendete. Dieses Upgrade führte zu einer 10-fachen Steigerung des Signals, einer drastischen Senkung der Produktionskosten und einer deutlichen Verbesserung der Haltbarkeit der Reagenzien 6,7.
In dem Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer HCR-Whole-Mount-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (HCR RNA WM-FISH) der dritten Generation, die für den Nachweis der räumlichen Lokalisierung und Expression eines beliebigen Gens entwickelt wurde 8,9. Bei dieser zweistufigen Methode werden zunächst Nukleinsäuresonden verwendet, die für die interessierende mRNA spezifisch sind, aber auch eine Initiatorerkennungssequenz enthalten. Im zweiten Schritt werden mit Fluorophoren markierte Haarnadeln verwendet, die an die Initiatorsequenz binden, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken (Abbildung 1). Dieses Verfahren ermöglicht auch das Multiplexen von zwei oder mehr RNA-Sonden und das Amplifizieren von Sondensignalen, um den RNA-Nachweis und die Quantifizierung zu erleichtern8. Die Visualisierung der Transkripthäufigkeit und der RNA-Lokalisierungsmuster von chemosensorischen Genen, die in den olfaktorischen Anhängen exprimiert werden, bietet den ersten Einblick in chemosensorische Genfunktionen und Geruchskodierungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die dritte Generation der Hybridisierungskettenreaktion (HCR) zeichnet sich durch ihre Empfindlichkeit und Robustheit zur Visualisierung mehrerer RNA-Ziele aus8. HCR WM-FISH wurde erfolgreich bei den Embryonen von Drosophila, Hühnern, Mäusen und Zebrafischen sowie bei den Larven von Nematoden und Zebrafischen eingesetzt 10,16,17. Moskitoantennen und Oberkieferpalpen sind in der Regel anfällig …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Margo Herre und dem Labor von Leslie Vosshall für die Bereitstellung ihres In-situ-Hybridisierungsprotokolls für Aedes aegypti olfaktorische Anhängsel. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health an C.J.P. (NIAID R01Al137078), ein HHMI Hanna Gray Stipendium an J.I.R., einen Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award an J.I.R. und ein Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship an J.I.R. unterstützt. Wir danken dem Johns Hopkins Malaria Research Institute und Bloomberg Philanthropies für ihre Unterstützung.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
