Hibridização da Reação em Cadeia de RNA Fluorescência de Monte Inteiro Hibridização in situ de Genes Quimiossensoriais em Apêndices Olfativos de Mosquitos
Summary
O artigo descreve os métodos e reagentes necessários para realizar a hibridização em cadeia de reação em cadeia de hibridização por fluorescência completa de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) para revelar informações sobre a resolução espacial e celular de genes de receptores quimiossensoriais na antena do mosquito e palpo maxilar.
Abstract
Os mosquitos são vetores eficazes de doenças mortais e podem navegar em seu ambiente químico usando receptores quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos. Compreender como os receptores quimiossensoriais estão organizados espacialmente nos apêndices olfativos periféricos pode oferecer insights sobre como o odor é codificado no sistema olfatório do mosquito e informar novas maneiras de combater a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos. O surgimento da hibridização de terceira geração de reação em cadeia de RNA, hibridação in situ de montagem total de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) permite o mapeamento espacial e o perfil de expressão simultânea de múltiplos genes quimiossensoriais. Aqui, descrevemos uma abordagem passo a passo para a realização do HCR RNA WM-FISH na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar. Investigamos a sensibilidade desta técnica examinando o perfil de expressão dos receptores olfatórios ionotrópicos. Perguntamos se a técnica de HCR WM-FISH descrita era adequada para estudos multiplexados por meio da ligação de sondas de RNA a três fluoróforos espectralmente distintos. Os resultados forneceram evidências de que o HCR RNA WM-FISH é robustamente sensível para detectar simultaneamente múltiplos genes quimiossensoriais na antena e apêndices olfativos palpos maxilares. Investigações posteriores atestam a adequação do HCR WM-FISH para o perfil de co-expressão de alvos de RNA duplo e triplo. Esta técnica, quando aplicada com modificações, pode ser adaptável para localizar genes de interesse nos tecidos olfativos de outras espécies de insetos ou em outros apêndices.
Introduction
Mosquitos vetores como Anopheles gambiae dependem de um rico repertório de genes quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos periféricos para prosperar em um mundo químico complexo e identificar odores comportamentalmente relevantes emanados de hospedeiros humanos, detectar fontes de néctar e localizar sítios de oviposição1. A antena do mosquito e o palpo maxilar são enriquecidos com genes quimiossensoriais que conduzem a detecção de odor nesses apêndices olfativos. Três classes principais de canais iônicos ligados a ligantes conduzem a detecção de odor nos apêndices olfativos de mosquitos: os receptores odorantes (ORs), que funcionam com um co-receptor odorante obrigatório (Orco); os receptores ionotrópicos (RIs), que interagem com um ou mais correceptores de RI (IR8a, IR25a e IR76b); os receptores gustativos quimiossensoriais (RGs), que funcionam como um complexo de três proteínas para detectar dióxido de carbono (CO2)1,2.
A hibridização in situ por fluorescência de RNA é uma ferramenta poderosa para detectar a expressão deRNAm 3 endógeno. Em geral, este método utiliza uma sonda de ácido nucleico de fita simples marcada com fluoróforo com sequência complementar a um RNAm alvo. A ligação da sonda de RNA fluorescente ao RNA alvo permite a identificação de células que expressam um transcrito de interesse. Avanços recentes agora permitem a detecção de transcritos em tecidos de mosquitos de montagem total 4,5. A primeira geração da tecnologia de reação em cadeia de hibridização (HCR) usou um amplificador HCR baseado em RNA; isso foi melhorado em um método de segunda geração que, em vez disso, usou DNA projetado para o amplificador HCR 6,7. Essa atualização resultou em um aumento de 10x no sinal, uma redução drástica no custo de produção e uma melhoria significativa na durabilidade dos reagentes 6,7.
No protocolo, descrevemos a utilização de um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA de terceira geração (HCR RNA WM-FISH) desenvolvido para detectar a localização espacial e expressão de qualquer gene 8,9. Este método de duas etapas utiliza primeiro sondas de ácido nucleico específicas para o mRNA de interesse, mas que também contêm uma sequência de reconhecimento do iniciador; a segunda etapa utiliza grampos marcados com fluoróforos que se ligam à sequência do iniciador para amplificar o sinal fluorescente (Figura 1). Este método também permite a multiplexação de duas ou mais sondas de RNA e amplificação de sinais de sonda para facilitar a detecção e quantificação de RNA8. A visualização da abundância de transcritos e dos padrões de localização de RNA de genes quimiossensoriais expressos nos apêndices olfativos oferece a primeira linha de conhecimento sobre as funções gênicas quimiossensoriais e a codificação de odores.
Protocol
Representative Results
Discussion
A terceira geração da reação em cadeia de hibridização (HCR) é notável por sua sensibilidade e robustez para visualizar vários alvos deRNA8. O HCR WM-FISH tem sido utilizado com sucesso em embriões de Drosophila, galinhas, camundongos e zebrafish, bem como em larvas de nematoides e zebrafish 10,16,17. Antenas de mosquito e palpos maxilares são tipicamente propensos a alta autofluoresc?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Margo Herre e ao laboratório Leslie Vosshall por compartilharem seu protocolo de hibridização in situ para apêndices olfativos do Aedes aegypti . Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde para C.J.P. (NIAID R01Al137078), uma bolsa HHMI Hanna Gray para J.I.R, um Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award para J.I.R, e uma bolsa de pós-doutorado do Johns Hopkins Malaria Research Institute para J.I.R. Agradecemos ao Johns Hopkins Malaria Research Institute e à Bloomberg Philanthropies pelo apoio.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
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