Hibridación Reacción en cadena ARN Fluorescencia de montaje completo Hibridación in situ de genes quimiosensoriales en apéndices olfativos de mosquitos
Summary
El artículo describe los métodos y reactivos necesarios para realizar la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación (HCR RNA WM-FISH) para revelar información sobre la resolución espacial y celular de los genes receptores quimiosensoriales en la antena del mosquito y el palpo maxilar.
Abstract
Los mosquitos son vectores eficaces de enfermedades mortales y pueden navegar por su entorno químico utilizando receptores quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos. Comprender cómo se organizan espacialmente los receptores quimiosensoriales en los apéndices olfativos periféricos puede ofrecer información sobre cómo se codifica el olor en el sistema olfativo de los mosquitos e informar nuevas formas de combatir la propagación de enfermedades transmitidas por mosquitos. La aparición de la hibridación in situ de fluorescencia in situ de ARN de reacción en cadena de hibridación de tercera generación (HCR RNA WM-FISH) permite el mapeo espacial y el perfil de expresión simultánea de múltiples genes quimiosensoriales. Aquí, describimos un enfoque paso a paso para realizar HCR RNA WM-FISH en la antena del mosquito Anopheles y el palpo maxilar. Investigamos la sensibilidad de esta técnica examinando el perfil de expresión de los receptores olfativos ionotrópicos. Preguntamos si la técnica HCR WM-FISH descrita era adecuada para estudios multiplexados mediante la conexión de sondas de ARN a tres fluoróforos espectralmente distintos. Los resultados proporcionaron evidencia de que HCR RNA WM-FISH es robustamente sensible para detectar simultáneamente múltiples genes quimiosensoriales en la antena y los apéndices olfativos palpes maxilares. Investigaciones posteriores atestiguan la idoneidad de HCR WM-FISH para el perfil de coexpresión de dianas de ARN dobles y triples. Esta técnica, cuando se aplica con modificaciones, podría ser adaptable para localizar genes de interés en los tejidos olfativos de otras especies de insectos o en otros apéndices.
Introduction
Los mosquitos vectores como Anopheles gambiae dependen de un rico repertorio de genes quimiosensoriales expresados en sus apéndices olfativos periféricos para prosperar en un mundo químico complejo e identificar olores relevantes para el comportamiento que emanan de huéspedes humanos, detectar fuentes de néctar ylocalizar sitios de oviposición. La antena del mosquito y el palpo maxilar están enriquecidos con genes quimiosensoriales que impulsan la detección de olores en estos apéndices olfativos. Tres clases principales de canales iónicos activados por ligandos impulsan la detección de olores en los apéndices olfativos de los mosquitos: los receptores de olores (OR), que funcionan con un correceptor de olores obligado (Orco); los receptores ionotrópicos (IR), que interactúan con uno o más correceptores IR (IR8a, IR25a e IR76b); los receptores gustativos quimiosensoriales (GR), que funcionan como un complejo de tres proteínas para detectar el dióxido de carbono (CO2)1,2.
La hibridación in situ de fluorescencia de ARN es una poderosa herramienta para detectar la expresión de ARNm endógeno3. En general, este método utiliza una sonda de ácido nucleico monocatenario marcada con fluoróforos con secuencia complementaria a un ARNm diana. La unión de la sonda de ARN fluorescente al ARN diana permite la identificación de células que expresan una transcripción de interés. Los avances recientes permiten ahora la detección de transcripciones en tejidos de mosquitos de monte entero 4,5. La primera generación de tecnología de reacción en cadena de hibridación (HCR) utilizaba un amplificador HCR basado en ARN; esto se mejoró en un método de segunda generación que, en cambio, utilizó ADN diseñado para el amplificador HCR 6,7. Esta actualización dio como resultado un aumento de 10 veces en la señal, una disminución drástica en el costo de producción y una mejora significativa en la durabilidad de los reactivos 6,7.
En el protocolo, describimos la utilización de un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN de montaje completo HCR de tercera generación (HCR RNA WM-FISH) diseñado para detectar la localización espacial y la expresión de cualquier gen 8,9. Este método de dos pasos utiliza primero sondas de ácido nucleico específicas para el ARNm de interés, pero que también contienen una secuencia de reconocimiento del iniciador; el segundo paso utiliza horquillas marcadas con fluoróforos que se unen a la secuencia del iniciador para amplificar la señal fluorescente (Figura 1). Este método también permite la multiplexación de dos o más sondas de ARN y la amplificación de las señales de la sonda para facilitar la detección y cuantificación del ARN8. La visualización de la abundancia de transcripciones y los patrones de localización del ARN de los genes quimiosensoriales expresados en los apéndices olfativos ofrece la primera línea de información sobre las funciones de los genes quimiosensoriales y la codificación de los olores.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tercera generación de reacción en cadena de hibridación (HCR) destaca por su sensibilidad y robustez para visualizar varias dianas de ARN8. HCR WM-FISH se ha utilizado con éxito en embriones de Drosophila, pollo, ratones y pez cebra, así como en larvas de nematodos y pez cebra 10,16,17. Las antenas de los mosquitos y los palpos maxilares suelen ser propensos a una alta autofluorescencia y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Margo Herre y al laboratorio de Leslie Vosshall por compartir su protocolo de hibridación in situ para apéndices olfativos de Aedes aegypti . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud a C.J.P. (NIAID R01Al137078), una beca Hanna Gray del HHMI a J.I.R, una beca Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award a J.I.R, y una beca postdoctoral del Instituto de Investigación de la Malaria Johns Hopkins a J.I.R. Agradecemos al Instituto de Investigación de la Malaria Johns Hopkins y a Bloomberg Philanthropies por su apoyo.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
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