Hybridiseringskedjereaktion RNA Helmonterad fluorescens In situ Hybridisering av kemosensoriska gener i myggans luktbihang
Summary
Artikeln beskriver de metoder och reagenser som är nödvändiga för att utföra hybridiseringskedjereaktion RNA helmonterad fluorescens in situ-hybridisering (HCR RNA WM-FISH) för att avslöja insikter i den rumsliga och cellulära upplösningen av kemosensoriska receptorgener i myggantennen och överkäkspalpen.
Abstract
Myggor är effektiva vektorer för dödliga sjukdomar och kan navigera i sin kemiska miljö med hjälp av kemosensoriska receptorer som uttrycks i deras luktbihang. Att förstå hur kemosensoriska receptorer är rumsligt organiserade i de perifera luktbihangen kan ge insikter om hur lukt kodas i myggornas luktsystem och informera om nya sätt att bekämpa spridningen av myggburna sjukdomar. Framväxten av tredje generationens hybridiseringskedjereaktions-RNA helmonterad fluorescens in situ-hybridisering (HCR RNA WM-FISH) möjliggör rumslig kartläggning och samtidig uttrycksprofilering av flera kemosensoriska gener. Här beskriver vi ett stegvis tillvägagångssätt för att utföra HCR RNA WM-FISH på Anopheles myggantenn och maxillär palp. Vi undersökte känsligheten hos denna teknik genom att undersöka uttrycksprofilen för jonotropa luktreceptorer. Vi frågade om HCR WM-FISH-tekniken som beskrevs var lämplig för multiplexade studier genom att binda RNA-sonder till tre spektralt distinkta fluoroforer. Resultaten gav bevis för att HCR RNA WM-FISH är robust känslig för att samtidigt detektera flera kemosensoriska gener i antennen och överkäkens palpluktbihang. Ytterligare undersökningar visar att HCR WM-FISH är lämpligt för samuttrycksprofilering av dubbel- och trippel-RNA-mål. Denna teknik, när den tillämpas med modifikationer, kan anpassas för att lokalisera gener av intresse i luktvävnaderna hos andra insektsarter eller i andra bihang.
Introduction
Myggvektorer som Anopheles gambiae förlitar sig på en rik repertoar av kemosensoriska gener som uttrycks i deras perifera luktbihang för att trivas i en komplex kemisk värld och identifiera beteendemässigt relevanta lukter som härrör från mänskliga värdar, upptäcka nektarkällor och lokalisera äggläggningsställen1. Myggantennen och överkäken är berikade med kemosensoriska gener som driver luktdetektering i dessa luktbihang. Tre huvudklasser av ligandstyrda jonkanaler driver luktdetektering i myggornas luktbihang: Odorantreceptorerna (OR), som fungerar med en obligat Odorant-receptor-co-receptor (Orco); de jonotropa receptorerna (IR), som interagerar med en eller flera IR-koreceptorer (IR8a, IR25a och IR76b); de kemosensoriska smakreceptorerna (GR), som fungerar som ett komplex av tre proteiner för att detektera koldioxid (CO2)1,2.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering är ett kraftfullt verktyg för att detektera uttrycket av endogent mRNA3. I allmänhet använder denna metod en fluoroformärkt enkelsträngad nukleinsyrasond med sekvens som är komplementär till ett mål-mRNA. Bindning av den fluorescerande RNA-sonden till mål-RNA möjliggör identifiering av celler som uttrycker ett transkript av intresse. De senaste framstegen gör det nu möjligt att detektera transkript i hela myggvävnader 4,5. Den första generationen av hybridiseringskedjereaktionsteknik (HCR) använde en RNA-baserad HCR-förstärkare; Detta förbättrades i en andra generationens metod som istället använde konstruerat DNA för HCR-förstärkaren 6,7. Denna uppgradering resulterade i en 10x ökning av signalen, en dramatisk minskning av produktionskostnaden och en betydande förbättring av hållbarheten hos reagenser 6,7.
I protokollet beskriver vi användningen av en tredje generationens HCR-helmonterad RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetod (HCR RNA WM-FISH) som är utformad för att detektera den rumsliga lokaliseringen och uttrycket av vilken gen som helst 8,9. Denna tvåstegsmetod använder först nukleinsyrasonder som är specifika för det mRNA som är av intresse, men som också innehåller en initiatorigenkänningssekvens; I det andra steget används fluoroformärkta hårnålar som binder till initiatorsekvensen för att förstärka den fluorescerande signalen (figur 1). Denna metod möjliggör också multiplexering av två eller flera RNA-sonder och förstärkning av sondsignaler för att underlätta RNA-detektion och kvantifiering8. Visualisering av transkriptöverflöd och RNA-lokaliseringsmönster för kemosensoriska gener som uttrycks i luktbihangen ger den första insikten om kemosensoriska genfunktioner och luktkodning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den tredje generationen av hybridiseringskedjereaktion (HCR) är anmärkningsvärd för sin känslighet och robusthet för att visualisera flera RNA-mål8. HCR WM-FISH har framgångsrikt använts på embryon från Drosophila, kycklingar, möss och zebrafiskar samt larver av nematoder och zebrafiskar 10,16,17. Myggantenner och överkäkspaper är vanligtvis benägna att drabbas av hög autofluores…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Margo Herre och Leslie Vosshall-labbet för att de delade med sig av sitt in-situ hybridiseringsprotokoll för Aedes aegypti luktbihang. Detta arbete stöddes av anslag från National Institutes of Health till C.J.P. (NIAID R01Al137078), ett HHMI Hanna Gray-stipendium till J.I.R, ett Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award till J.I.R. och ett Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship till J.I.R. Vi tackar Johns Hopkins Malaria Research Institute och Bloomberg Philanthropies för deras stöd.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
