Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu,
Summary
Makale, sivrisinek anteni ve maksiller palptaki kemosensoriyel reseptör genlerinin uzamsal ve hücresel çözünürlüğüne ilişkin içgörüleri ortaya çıkarmak için hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (HCR, RNA, WM-FISH) gerçekleştirmek için gerekli yöntemleri ve reaktifleri açıklamaktadır.
Abstract
Sivrisinekler ölümcül hastalıkların etkili vektörleridir ve koku alma eklerinde eksprese edilen kemosensör reseptörlerini kullanarak kimyasal çevrelerinde gezinebilirler. Kemosensoriyel reseptörlerin periferik koku alma eklerinde uzamsal olarak nasıl organize edildiğini anlamak, sivrisinek koku alma sisteminde kokunun nasıl kodlandığına dair içgörüler sunabilir ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasıyla mücadele etmenin yeni yollarını bilgilendirebilir. Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun (HCR RNA WM-FISH) ortaya çıkışı, çoklu kemosensoriyel genlerin uzamsal haritalanmasına ve eşzamanlı ekspresyon profiline izin verir. Burada, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp üzerinde HCR RNA WM-FISH gerçekleştirmek için aşamalı bir yaklaşım açıklıyoruz. Bu tekniğin duyarlılığını, iyonotropik koku alma reseptörlerinin ekspresyon profilini inceleyerek araştırdık. Tarif edilen HCR WM-FISH tekniğinin, RNA problarını spektral olarak farklı üç florofora bağlayarak çoğullanmış çalışmalar için uygun olup olmadığını sorduk. Sonuçlar, HCR RNA WM-FISH’in anten ve maksiller palp koku alma uzantılarındaki çoklu kemosensör genleri aynı anda tespit etmek için sağlam bir şekilde duyarlı olduğuna dair kanıt sağladı. Daha ileri araştırmalar, HCR WM-FISH’in ikili ve üçlü RNA hedeflerinin birlikte ekspresyon profilinin çıkarılması için uygunluğunu doğrulamaktadır. Bu teknik, modifikasyonlarla uygulandığında, diğer böcek türlerinin koku alma dokularında veya diğer uzantılarda ilgilenilen genleri lokalize etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Anopheles gambiae gibi sivrisinek vektörleri, karmaşık bir kimyasal dünyada gelişmek ve insan konakçılardan yayılan davranışsal olarak ilgili kokuları tanımlamak, nektar kaynaklarını tespit etmek ve yumurtlama bölgelerini bulmak için periferik koku uzantılarında ifade edilen zengin bir kemosensör gen repertuarına güvenir1. Sivrisinek anteni ve maksiller palp, bu koku uzantılarında koku algılamayı sağlayan kemosensör genlerle zenginleştirilmiştir. Üç ana ligand kapılı iyon kanalı sınıfı, sivrisineklerin koku alma uzantılarında koku algılamayı sağlar: zorunlu bir Koku reseptörü ko-reseptörü (Orco) ile işlev gören Koku reseptörleri (OR’ler); bir veya daha fazla IR koreseptörü (IR8a, IR25a ve IR76b) ile etkileşime giren İyonotropik reseptörler (IR’ler); karbondioksiti (CO2) tespit etmek için üç proteinden oluşan bir kompleks olarak işlev gören kemosensoriyel Tat reseptörleri (GR’ler)1,2.
RNA floresansı in situ hibridizasyon, endojen mRNA3’ün ekspresyonunu tespit etmek için güçlü bir araçtır. Genel olarak, bu yöntem, bir hedef mRNA’yı tamamlayıcı diziye sahip florofor etiketli tek sarmallı bir nükleik asit probu kullanır. Floresan RNA probunun hedef RNA’ya bağlanması, ilgilenilen bir transkripti ifade eden hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Son gelişmeler artık tam monteli sivrisinek dokularındatranskriptlerin saptanmasını mümkün kılmaktadır 4,5. Birinci nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) teknolojisi, RNA tabanlı bir HCR amplifikatörü kullandı; bu, bunun yerine HCR amplifikatörü 6,7 için tasarlanmış DNA’yı kullanan ikinci nesil bir yöntemle geliştirildi. Bu yükseltme, sinyalde 10 kat artış, üretim maliyetinde dramatik bir düşüş vereaktiflerin dayanıklılığında önemli bir iyileşme ile sonuçlandı 6,7.
Protokolde, herhangi bir geninuzamsal lokalizasyonunu ve ekspresyonunu tespit etmek için tasarlanmış üçüncü nesil HCR tam montajlı RNA floresan in situ hibridizasyon (HCR RNA WM-FISH) yönteminin kullanımını açıklıyoruz 8,9. Bu iki aşamalı yöntem ilk olarak, ilgilenilen mRNA’ya özgü, ancak aynı zamanda bir başlatıcı tanıma dizisi içeren nükleik asit problarını kullanır; ikinci adım, floresan sinyalini yükseltmek için başlatıcı dizisine bağlanan florofor etiketli saç tokalarını kullanır (Şekil 1). Bu yöntem aynı zamanda iki veya daha fazla RNA probunun çoğullanmasına ve RNA tespitini ve nicelemeyi kolaylaştırmak için prob sinyallerinin yükseltilmesineizin verir 8. Koku eklerinde eksprese edilen kemosensör genlerin transkript bolluğu ve RNA lokalizasyon modellerini görselleştirmek, kemosensoriyel gen fonksiyonları ve koku kodlaması hakkında ilk içgörü satırını sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR), birkaç RNA hedefini görselleştirme konusundaki duyarlılığı ve sağlamlığı ile dikkat çekicidir8. HCR WM-FISH, Drosophila, tavuk, fare ve zebra balığı embriyolarının yanı sıra nematod ve zebra balığılarvalarında başarıyla kullanılmıştır 10,16,17. Sivrisinek antenleri ve maksiller palplar tipik olarak yüksek otoflo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Margo Herre ve Leslie Vosshall laboratuvarına, Aedes aegypti koku uzantıları için yerinde hibridizasyon protokollerini paylaştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden C.J.P.’ye (NIAID R01Al137078), HHMI Hanna Gray’in JIR’a bursu, JIR’ye Johns Hopkins Doktora Sonrası Hızlandırıcı Ödülü ve Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü Doktora Sonrası Bursu’na verilen hibelerle desteklenmiştir. Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü ve Bloomberg Philanthropies’e destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
