Her presenterer vi en protokoll for aktiv stedsunngåelsestest, et hippocampus-avhengig romlig læringsparadigme designet for gnagere. Endring av nøkkelparametere gjør det mulig å re-teste dyr før og etter behandlinger eller over tid.
Hippocampus-avhengig romlig læring hos gnagere har blitt testet ved hjelp av en rekke metoder. Disse inkluderer Morris vannlabyrint (MWM), Y-labyrint og nye objektlokaliseringsoppgaver (NOL). Mer nylig har oppgaven med å unngå aktive steder (APA) blitt utviklet som et alternativ til disse mer tradisjonelle tilnærmingene. I APA-oppgaven må mus bruke romlige signaler plassert rundt en roterende arena for å unngå en stasjonær sjokksone. På grunn av de mange parametrene som kan justeres, har APA-oppgaven vist seg å være en svært allsidig tilnærming. Den egner seg til å bli brukt i lengderetningen og gjentatte ganger for samme kohort av mus. Her gir vi en detaljert protokoll for å kunne utføre APA-oppgaven. Vi fremhever også alternative APA-tilnærminger som kan brukes til å undersøke ulike komponenter i romlig læring. Vi beskriver prosessene for datainnsamling og analyse. Kritiske trinn under APA-oppgaven diskuteres for å øke sannsynligheten for vellykket gjennomføring av testen. TFO-oppgaven har flere fordeler i forhold til mer tradisjonelle romlige navigasjonstester. Det er hensiktsmessig å bruke med eldre mus eller de med sykdomsfenotyper som Alzheimers sykdom. Kompleksiteten i oppgaven kan enkelt endres, slik at et bredt spekter av musestammer kan testes. Videre er APA-oppgaven egnet for testing av dyr som har gjennomgått kirurgi eller eksperimentelle inngrep som kan ha påvirket motorisk eller nevral funksjon, for eksempel hjerneslag eller traumatisk hjerneskade.
Active place avoidance (APA) er et effektivt verktøy for å teste hippocampus-avhengig romlig læring hos gnagere 1,2,3,4. Under APA-oppgaven plasseres dyret på en roterende arena og må bruke visuelle signaler for å orientere seg og unngå en aversiv sjokksone5. Rotasjonen av arenaen sikrer at musen ikke kan bruke en idiotetisk tilnærming til navigering, og det kan heller ikke brukes duftmerker, da disse signalene roterer på plattformen mens sjokksonen forblir stasjonær5. Endring av arenaens hastighet og retning, samt plasseringen av sjokksonen og visuelle signaler, gjør det mulig å teste mus flere ganger 6,7,8. APA tilbyr flere forskjellige fordeler sammenlignet med Morris vannlabyrint (MWM), en av de mest brukte romlige læringstestene. Det er viktig at mus har en aversjon mot svømming og synes MWM-oppgaven er ekstremt stressende9. Videre har eldre mus blitt rapportert å flyte under MWM-oppgaven10, noe som gjør den uegnet som en romlig læringsoppgave i mange tilfeller. Videre, ettersom MWM-oppgaven krever en skjult, nedsenket plattform for musene å finne under testing. Dette krever at vannet er ugjennomsiktig, noe som vanligvis oppnås ved tilsetning av hvit maling. Sporing og analyse av dyr under atferdsoppgaver krever tilstrekkelig kontrast mellom motiv og omgivelser, unntatt visse musestammer som sveitsisk eller BALB / c fra å bli testet i MWM. I TFO-oppgaven omgås dette problemet ved tilsetning av svart plast under rutenettet.
Flere APA-paradigmer er designet for å teste romlig læring, og demonstrerer nytten som et effektivt atferdsverktøy. For eksempel oppnås anskaffelse, oppbevaring og konsolidering av romlig læring vanligvis ved daglig testing av dyr som kan variere fra 3-5 dager 6,7,11,12. Hukommelse og læring kvantifiseres ved å sammenligne antall sjokk mottatt hver anskaffelsesdag. Tid til første inngang og maksimal tid for å unngå sjokksonen er også viktige parametere som kan brukes til å bestemme endringer i læringsevne under oppgaven. Alternativt kan romlig arbeidsminne testes ved å gjennomføre en enkelt, 30 min APA-økt 2,13 hvor romlig læring måles som endringer i økten ved å sammenligne ytelse, for eksempel sjokknummer, i 5 min bins.
I denne artikkelen beskriver vi APA-oppgaven og fremhever nøkkelfunksjonene som må vurderes når du utfører denne romlige læringstesten.
Avslutningsvis er den aktive stedsunngåelsestesten en effektiv romlig læringsoppgave som kan brukes på en rekke musestammer og eksperimentelle forhold. APA-oppgaven overvinner begrensninger knyttet til andre romlige læringsparadigmer14, for eksempel MWM, som er stressende for musene målt ved kortisolnivåer9. MWM er også uegnet for eldre mus, hvor de har blitt rapportert å flyte under oppgaven10. Selv om andre romlige læringstester, som Barnes-labyrinten og den nye objektplasseringstesten, er mindre stressende, er de begrenset av hvor ofte gjentatt testing kan utføres på samme kohorte av mus. Derfor er den største fordelen med APA-oppgaven at den kan brukes flere ganger, da flere parametere kan justeres for å opprettholde nyheten. Faktisk har vi brukt APA-oppgaven opptil 5 ganger på samme kohort av mus for å undersøke effekten av hippocampus-ablasjon og den påfølgende effekten av trening8. I hvert tilfelle ble parametrene, inkludert arenarotasjon, sjokksone og romlige signaler, endret mellom testene. Dette var effektivt for å sikre at musene brukte romlige navigasjonssignaler for å lære oppgaven på nytt, som det fremgår av kontrolldyrene, som startet med et høyt antall støt og deretter avtok i løpet av påfølgende testdager for hver testperiode8. Vanligvis, på slutten av et 5-dagers testparadigme, anser vi at ethvert dyr som mottok mer enn 10 støt på den siste dagen eller har en maksimal unngåelse på mindre enn 60 s, ikke har lært paradigmet.
Utover muligheten til enkelt å endre innstillinger for å tillate flere runder med romlig testing, sikrer APA-oppgaven at mus må bruke romlig navigasjon for effektivt å unngå sjokksonen. For eksempel må dyr bruke eksterne signaler for å lokalisere og unngå å komme inn i den stasjonære sjokksonen ved å navigere bort fra den5. Når arenaen roterer, kan ikke dyr bruke en idiotetisk tilnærming til navigering, og de kan heller ikke bruke eksteroseptive signaler som lukt fordi disse signalene roterer med arenaen mens sjokksonen og romlige signaler forblir stasjonære5.
Det er også viktig å sikre at mus er riktig vant til forskeren og TFO-arenaen. Intensiteten av fotstøt må også optimaliseres, da både for lav og for høy støtintensitet kan kompromittere musens evne til å lære og utføre oppgaven5. Støtintensiteten er vanligvis satt til 0,5 mA og bør ikke overstige 0,7 mA. For dyr som har økt angstlignende oppførsel, bør du vurdere å redusere både lysintensitet og fotstøtintensitet. Økt angst under APA-oppgaven kan presentere seg som enten overdreven hopping, ukontrollert løping i arenaen eller langvarig frysing. Protokollen beskrevet her brukte en sjokkintensitet på 0,5 mA, samme intensitet som tidligere har blitt brukt med BALB / c, som er kjent for å ha høyere angstlignende oppførsel15.
Her beskriver vi dyresporingsprogramvaren levert av selskapet som leverte den aktive stedsunngåelsesriggen som ble brukt. Alternativ videosporingsprogramvare er også egnet for å analysere atferdsytelse. Disse programmene kan også måle og analysere museytelse nøyaktig under APA-oppgaver. Disse programmene tillater opprettelse av flere soner og steder innenfor APA-arenaen for å vurdere atferd. Arenainnstillingen for en APA består av en trekantet sjokksone, hvor antall innganger, tid for å først komme inn og tid brukt i sjokksonen måles. Ytterligere soner kan også legges til i arenaen. For eksempel kan vi legge til en sentral sone eller en sone overfor sjokksonen for å måle tiden brukt og avstanden som er reist i disse sonene som en dyrestrategi for å unngå den aversive sonen. Disse programmene sporer musesenteret for masse, som deretter lagres og vises over referanserammen for visuell inspeksjon (figur 6A, B). Endelig er det også mulig å lage et tetthetsvarmekart for individuell og gruppeytelse (figur 6C).
Når du utfører APA-oppgaven, er det potensielle problemer som må løses. Noen ganger må mus utelukkes fra analysen på grunn av manglende respons på sjokksonen. Som alltid bør utelukkelse bare vurderes når de oppfyller forhåndsdefinerte utliggervilkår, for eksempel faller utenfor 2 standardavvik fra gjennomsnittet. Komplekse atferdsoppgaver som APA krever vanligvis høye N-verdier av dyr. Vi foreslår at du gjennomfører en effektanalyse for å beregne riktig prøvestørrelse før du utfører APA. Dette vil avhenge av belastningen som brukes og behandlingsgruppene. Av erfaring finner vi at en n-verdi på 10 eller mer for hver gruppe gir tilstrekkelig kraft når man gjennomfører APA-eksperimenter. Hovedproblemet med denne oppgaven er å sikre sporing av musen av høy kvalitet under oppgaven. Tilvenningsfasen av oppgaven bør brukes til å bekrefte at dette skjer. Mus som ikke reagerer på et støt skyldes ofte scat mellom gitterstengene. Det er derfor viktig å rengjøre riggen etter hvert dyr og fjerne eventuell scat eller urin. Dette vil også redusere stresset for dyrene som følger. APA-oppgaven innebærer vanligvis et 5-dagers paradigme, som kan presentere noen begrensninger for studier som involverer intervensjoner som er effektive mindre enn 5 dager; Imidlertid kan korttidshukommelse eller romlig læringsoppkjøp fortsatt vurderes for slike studier ved hjelp av 30 min, enkeltøkttilnærming.
Oppsummert gir denne artikkelen en detaljert beskrivelse av hvordan du konfigurerer og bruker paradigmet for å unngå aktivt sted for å teste romlig læring av mus. Evnen til å endre forholdene slik at flere musestammer av varierende farge kan testes, er en klar fordel i forhold til andre, mer tradisjonelle romlige tester som MWM. Videre tillater modifikasjonen av flere parametere gjentatt testing slik at endringene i romlig læring kan sammenlignes nøyaktig under ulike eksperimentelle paradigmer eller under fysiologisk aldring. På kort tid har APA-testen vist seg å være et nøyaktig og effektivt alternativ for hippocampus-avhengig romlig læring. I fremtiden kan APA-oppgaven brukes som en pålitelig metode for å vurdere terapeutiske eller treningsintervensjoner på kognitiv og romlig oppførsel i både villtype og transgene mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behaviour Facility for utvikling og vedlikehold av apparatet beskrevet i dette manuskriptet.
Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |