Denne protokollen beskriver en flerfarget immunfluorescensteknikk for evaluering av rottemodellen av allergisk rhinitt.
Allergisk rhinitt (AR) er en kronisk, ikke-smittsom inflammatorisk sykdom i neseslimhinnen, primært mediert av spesifikt immunglobulin E (IgE), som påvirker omtrent 10% -20% av verdens befolkning. Mens immunfluorescens (IF) farging lenge har vært en standardteknikk for å oppdage sykdomsspesifikt proteinuttrykk, er konvensjonelle IF-teknikker begrenset i deres evne til å oppdage ekspresjonsnivåene av tre eller flere proteiner i samme prøve. Følgelig har flerfarget IF-teknikker blitt utviklet de siste årene, noe som tillater samtidig merking av flere mål i celler eller vev.
Denne protokollen gir en omfattende oversikt over prosessen for å etablere en rottemodell av AR, oppnå neseslimhinneprøver og de tekniske prosedyrene for flerfarget immunfluorescens. Alle rotter i AR-gruppen viste typiske symptomer som nysing, rennende nese og kløende nese, med atferdsobservasjoner som scoret ≥5 poeng. Farging av hematoksylin og eosin (H&E) viste økt inflammatorisk celletall og forstyrret neseslimhinneintegritet i AR-gruppen. Flerfarget immunfluorescens (mIF) viste økt ekspresjon av RORγt og TICAM-1, mens Foxp3-ekspresjon ble redusert i neseslimhinnevevet hos AR-rotter.
Allergisk rhinitt (AR) er en kronisk, ikke-infeksiøs betennelsessykdom i neseslimhinnen primært mediert av spesifikt immunglobulin E (IgE)1,2. Det er preget av symptomer som nysing, rennende nese, nesetetthet og nesekløe. Med industrialisering og urbanisering øker forekomsten av AR gradvis, og påvirker omtrent 10% -20% av verdens befolkning1. Immunfluorescens (IF) teknikken er en fluorescerende fargemetode som benytter en antistoff-antigenbindende reaksjon. Det kan brukes til å oppdage og kvantifisere fordelings- og ekspresjonsnivåene av spesifikke proteiner i biologiske vev eller celler. I AR-forskning kan IF samtidig oppdage flere mål, inkludert AR-relaterte cytokiner, inflammatoriske celler, reseptorer og mer, noe som letter utforskningen av AR-patogenesen og effekten av narkotika 3,4,5,6.
Den flerfargede immunfluorescensfargeprosessen (mIF) ligner på tradisjonell IF, med tillegg av et antistoffelueringstrinn under hver fargingsrunde. Denne modifikasjonen muliggjør samtidig påvisning av flere biomarkører på samme vevsseksjon gjennom sekvensiell enkeltmerking og flere runder med ny farging. mIF er basert på tyramidsignalforsterkning (TSA), noe som muliggjør gjentatte sykluser med TSA-fluorescerende farging og bruk av mikrobølgeoppvarming for å fjerne antistoffer samtidig som fluorescerende signaler 7,8 beholdes. Sammenlignet med konvensjonell IF har mIF flere fordeler: (1) det kan oppdage svakt uttrykte antigener som er utfordrende å identifisere med konvensjonell IF 9,10; (2) det gir farging av høy kvalitet med et forbedret signal-støy-forhold; (3) det gjør det mulig å kvantifisere vevsspesifikke strukturer og regioner av interesse11; (4) multipleksing av flere veier utnytter effektivt vev og sparer begrensede patologiske ressurser12; (5) multiparameteranalyse gjennom mIF gir dypere innsikt i vev, og avdekker skjult biologisk informasjon13.
Samlet sett tillater mIF observasjon av forskjellige antigenuttrykk og distribusjoner i samme prøve, noe som letter studiet av målproteiner. I fremtiden vil forskere som ønsker å forstå uttrykket og fordelingen av flere målproteiner, finne denne teknikken et verdifullt valg. Denne studien demonstrerer anvendelsen av mIF for farging av neseslimhinneprøver fra rotter med AR og evaluerer etableringen av en rottemodell av AR.
Allergisk rhinitt (AR) er en ikke-smittsom inflammatorisk sykdom i neseslimhinnen som skyldes en kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer. Det har blitt et globalt helseproblem, som påvirker arbeidseffektiviteten, reduserer livskvaliteten, svekker søvn, kognitiv funksjon og forårsaker irritabilitet og tretthet. AR påvirker 10%-20% av verdens befolkning¹ og har betydelige økonomiske kostnader, noe som forårsaker årlige tap på opptil 30-50 milliarder euro i EU-land18. Videre har f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2021YJ0175).
Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX 2023-0100 | |
TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |