Immunofluorescensmärkning i nässlemhinnevävnadssnitt hos råttor med allergisk rinit via flerfärgad immunanalys
Summary
Detta protokoll beskriver en flerfärgad immunofluorescensteknik för att utvärdera råttmodellen för allergisk rinit.
Abstract
Allergisk rinit (AR) är en kronisk, icke-infektiös inflammatorisk sjukdom i nässlemhinnan, främst medierad av specifikt immunglobulin E (IgE), som drabbar cirka 10-20 % av världens befolkning. Medan immunofluorescensfärgning (IF) länge har varit en standardteknik för att detektera sjukdomsspecifikt proteinuttryck, är konventionella IF-tekniker begränsade i sin förmåga att detektera uttrycksnivåerna av tre eller fler proteiner i samma prov. Följaktligen har flerfärgade IF-tekniker utvecklats under de senaste åren, vilket möjliggör samtidig märkning av flera mål i celler eller vävnader.
Detta protokoll ger en omfattande översikt över processen för att etablera en råttmodell av AR, erhålla nässlemhinneprover och de tekniska procedurerna för flerfärgad immunofluorescens. Alla råttor i AR-gruppen uppvisade typiska symtom som nysningar, rinnande näsa och kliande näsa, med beteendeobservationer som gav ≥5 poäng. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) avslöjade ökat antal inflammatoriska celler och störd nässlemhinneintegritet i AR-gruppen. Flerfärgad immunofluorescens (mIF) visade ökat uttryck av RORγt och TICAM-1, medan Foxp3-uttryck minskade i nässlemhinnevävnaden hos AR-råttor.
Introduction
Allergisk rinit (AR) är en kronisk, icke-infektiös inflammatorisk sjukdom i nässlemhinnan som främst medieras av specifikt immunglobulin E (IgE)1,2. Det kännetecknas av symtom som nysningar, rinnande näsa, nästäppa och klåda i näsan. Med industrialisering och urbanisering ökar förekomsten av AR gradvis, vilket påverkar cirka 10-20 % av världens befolkning1. Immunofluorescenstekniken (IF) är en fluorescerande färgningsmetod som använder en antikropps-antigenbindningsreaktion. Det kan användas för att detektera och kvantifiera fördelningen och uttrycksnivåerna av specifika proteiner i biologiska vävnader eller celler. Inom AR-forskning kan IF samtidigt upptäcka flera mål, inklusive AR-relaterade cytokiner, inflammatoriska celler, receptorer med mera, vilket underlättar utforskningen av AR-patogenes och effekterna av läkemedel 3,4,5,6.
Färgningsprocessen för flerfärgad immunofluorescens (mIF) liknar traditionell IF, med tillägg av ett antikroppselueringssteg under varje färgningsomgång. Denna modifiering möjliggör samtidig detektion av flera biomarkörer på samma vävnadssnitt genom sekventiell enkelmärkning och flera omgångar av omfärgning. mIF är baserad på tyramidsignalförstärkning (TSA), vilket möjliggör upprepade cykler av TSA-fluorescerande färgning och användning av mikrovågsuppvärmning för att avlägsna antikroppar samtidigt som fluorescerande signaler bibehålls 7,8. I jämförelse med konventionell IF erbjuder mIF flera fördelar: (1) den kan detektera svagt uttryckta antigener som är svåra att identifiera med konventionell IF 9,10; (2) det ger högkvalitativ färgning med ett förbättrat signal-brusförhållande; (3) Det gör det möjligt att kvantifiera vävnadsspecifika strukturer och regioner av intresse11. (4) multiplexering av flera vägar effektivt utnyttjar vävnader och bevarar begränsade patologiska resurser12; (5) Multiparameteranalys genom mIF ger djupare insikter i vävnader och avslöjar dold biologisk information13.
Sammantaget tillåter mIF observation av olika antigenuttryck och distributioner inom samma prov, vilket underlättar studier av målproteiner. I framtiden kommer forskare som vill förstå uttrycket och fördelningen av flera målproteiner att finna denna teknik som ett värdefullt val. Denna studie demonstrerar tillämpningen av mIF för färgning av nässlemhinneprover från råttor med AR och utvärderar etableringen av en råttmodell av AR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Allergisk rinit (AR) är en icke-infektiös inflammatorisk sjukdom i nässlemhinnan som beror på en kombination av miljömässiga och genetiska faktorer. Det har blivit ett globalt hälsoproblem som påverkar arbetseffektiviteten, minskar livskvaliteten, försämrar sömnen, den kognitiva funktionen och orsakar irritabilitet och trötthet. Invasiv import påverkar 10–20 % av världens befolkning¹ och medför betydande ekonomiska kostnader, vilket orsakar årliga förluster på upp till 30–50 miljarder euro i EU-lä…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Sichuanprovinsens avdelning för vetenskap och teknik (2021YJ0175).
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Recherche en cancérologie. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Recherche en cancérologie. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue – a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Recherche en cancérologie. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Recherche en cancérologie. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
