Мониторинг обучения мелкой и ассоциативной моторики у мышей с помощью лестницы Эразма
Summary
В этой статье представлен протокол, который позволяет проводить неинвазивную и автоматизированную оценку мелкой моторики, а также адаптивное и ассоциативное моторное обучение при выполнении задач с помощью устройства под названием Erasmus Ladder. Сложность задачи может быть титрована для выявления двигательных нарушений в диапазоне от основных до незначительных степеней.
Abstract
Поведение формируется действиями, а действия требуют двигательных навыков, таких как сила, координация и обучение. Ни одно из видов поведения, необходимых для поддержания жизни, не было бы возможным без способности переходить из одного положения в другое. К сожалению, двигательные навыки могут быть нарушены при широком спектре заболеваний. Таким образом, изучение механизмов двигательных функций на клеточном, молекулярном и цепном уровнях, а также понимание симптомов, причин и прогрессирования двигательных нарушений имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения. Для этой цели часто используются модели мышей.
В этой статье описывается протокол, который позволяет контролировать различные аспекты двигательной производительности и обучения у мышей с помощью автоматизированного инструмента под названием Erasmus Ladder. Тест включает в себя две фазы: начальную фазу, в которой мышей обучают перемещаться по горизонтальной лестнице, построенной из неправильных ступеней («обучение мелкой моторики»), и вторую фазу, когда на пути движущегося животного появляется препятствие. Возмущение может быть неожиданным («проблемное моторное обучение») или предваряться слуховым тоном («ассоциативное моторное обучение»). Задача проста в проведении и полностью поддерживается автоматизированным программным обеспечением.
В этом отчете показано, как различные показания теста, при анализе с помощью чувствительных статистических методов, позволяют точно контролировать моторику мышей с использованием небольшой когорты мышей. Мы предполагаем, что метод будет высокочувствителен для оценки двигательных адаптаций, обусловленных изменениями окружающей среды, а также тонких моторных дефицитов на ранних стадиях у мутантных мышей с нарушенными двигательными функциями.
Introduction
Для оценки моторных фенотипов у мышей было разработано множество тестов. Каждый тест дает информацию о конкретном аспекте двигательногоповедения1. Например, тест открытого поля информирует об общей локомоции и тревожном состоянии; испытания на координацию и равновесие на вращающейся и шагающей балке; Анализ футпринта связан с походкой; беговая дорожка или беговое колесо на принудительных или произвольных физических упражнениях; А сложное колесо — это обучение моторике. Чтобы проанализировать моторные фенотипы мышей, исследователи должны проводить эти тесты последовательно, что требует много времени и усилий, а часто и нескольких когорт животных. Если есть информация на клеточном или сетевом уровне, исследователь обычно выбирает тест, который отслеживает связанный аспект и вытекает из него. Тем не менее, парадигмы, которые бы различали различные аспекты моторного поведения автоматическим способом, отсутствуют.
В этой статье описывается протокол использования Erasmus Ladder 2,3, системы, которая позволяет комплексно оценить различные особенности моторного обучения у мышей. Основными преимуществами метода являются воспроизводимость и чувствительность метода, а также способность титровать моторные трудности и отделять дефицит двигательных функций от нарушения ассоциативно-моторного обучения. Основной компонент состоит из горизонтальной лестницы с чередующимися высокими (H) и низкими (L) перекладинами, оснащенных сенсорными датчиками, которые определяют положение мыши на лестнице. Лестница изготовлена из 2 x 37 ступеней (L, 6 мм; H, 12 мм), расположенные на расстоянии 15 мм друг от друга и расположенные попеременно слева и справа с зазорами 30 мм (рис. 1А). Перекладины можно перемещать по отдельности для создания различных уровней сложности, то есть создания препятствия (поднимая высокие ступени на 18 мм). В сочетании с автоматизированной системой регистрации и ассоциацией модификаций паттерна ступеней с сенсорными стимулами, лестничные тесты Эразма для обучения мелкой моторики и адаптации двигательных функций в ответ на вызовы окружающей среды (появление более высокой ступени для имитации препятствия, безусловный стимул [УЗИ]) или ассоциацию с сенсорными стимулами (тон, условный стимул [CS]). Тестирование включает в себя два отдельных этапа, каждый из которых оценивает улучшение двигательных характеристик в течение 4 дней, в течение которых мыши проходят сеанс из 42 последовательных испытаний в день. На начальном этапе мышей обучают перемещаться по лестнице, чтобы оценить «хорошее» или «квалифицированное» моторное обучение. Вторая фаза состоит из чередующихся испытаний, где на пути движущегося животного появляется препятствие в виде более высокой ступени. Возмущение может быть неожиданным для оценки «проблемного» моторного обучения (испытания только для США) или сигналом слуха для оценки «ассоциативного» моторного обучения (парные испытания).
Лестница Эразма была разработана относительно недавно 2,3. Он не получил широкого распространения, потому что настройка и оптимизация протокола требовали целенаправленных усилий и был специально разработан для оценки ассоциативного обучения, зависящего от мозжечка, без детального изучения его потенциала для выявления других двигательных дефицитов. На сегодняшний день его способность выявлять тонкие двигательные нарушения, связанные с дисфункцией мозжечка, у мышей 3,4,5,6,7,8. Например, мыши с нокаутом connexin36 (Cx36), у которых в оливарных нейронах нарушены щелевые контакты, демонстрируют дефицит возбуждения из-за отсутствия электротонической связи, но моторный фенотип было трудно определить. Тестирование с использованием лестницы Эразма показало, что роль нижних оливарных нейронов в задаче обучения мозжечковой моторики заключается в кодировании точного временного кодирования стимулов и облегчении зависимых от обучения реакций на неожиданныесобытия. Мышь с нокаутом Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1), модель синдрома Fragile-X-Syndrome (FXS), демонстрирует хорошо известные когнитивные нарушения наряду с более легкими дефектами в формировании процедурной памяти. Нокауты Fmr1 не показали существенных различий во времени шагов, ошибках в каждом испытании или улучшении двигательных характеристик по сравнению с занятиями по лестнице Эразма, но не смогли приспособить свой паттерн ходьбы к внезапно появившемуся препятствию по сравнению с их однопометниками дикого типа (WT), что подтверждает специфический дефицит процедурной и ассоциативной памяти 3,5. Кроме того, клеточно-специфические мутантные линии мышей с дефектами функции мозжечка, включая нарушение выхода клеток Пуркинье, потенцирования и выхода клеток интернейронов или гранул молекулярного слоя, демонстрировали проблемы в координации движений с измененным приобретением эффективных шаговых паттернов и в количестве шагов, предпринятых для пересечениялестницы. Травма головного мозга у новорожденных вызывает мозжечковый дефицит обучения и дисфункцию клеток Пуркинье, которые также могут быть обнаружены с помощью лестницы Эразма 7,8.
В этом видео мы представляем подробное пошаговое руководство, в котором подробно описана настройка поведенческой комнаты, протокол поведенческого теста и последующий анализ данных. Этот отчет создан для того, чтобы быть доступным и удобным для пользователя, и разработан специально для помощи новичкам. Этот протокол дает представление о различных фазах двигательной тренировки и ожидаемых двигательных паттернах, которые усваивают мыши. Наконец, в статье предлагается систематический рабочий процесс для анализа данных с использованием мощного нелинейного регрессионного подхода, дополненный ценными рекомендациями и предложениями по адаптации и применению протокола в других исследовательских контекстах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лестница Эразма предоставляет значительные преимущества для оценки моторного фенотипа по сравнению с существующими подходами. Тестирование легко проводить, оно автоматизировано, воспроизводимо и позволяет исследователям оценивать различные аспекты двигательного поведения по отде…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Выражаем признательность аудиовизуальному технику и видеопродюсеру Ребеке Де лас Эрас Понсе, а также главному ветеринарному врачу Гонсало Морено дель Валю за надзор за надлежащей практикой во время экспериментов на мышах. Работа финансировалась за счет грантов Программы передового опыта GVA (2022/8) и Испанского исследовательского агентства (PID2022143237OB-I00) Исабель Перес-Отаньо.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user’s guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- . Available from: https://www.noldus.com/erasmusladder (2023)
- Cupido, A., et al. . Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
