Optische Klärung und Markierung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie in der großflächigen Bildgebung des menschlichen Gehirns
Summary
Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.
Abstract
Trotz der zahlreichen Clearing-Techniken, die im letzten Jahrzehnt entstanden sind, bleibt die Verarbeitung postmortaler menschlicher Gehirne aufgrund ihrer Dimensionen und Komplexität, die die Bildgebung mit Mikrometerauflösung besonders schwierig machen, eine herausfordernde Aufgabe. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, um die Rekonstruktion volumetrischer Abschnitte des menschlichen Gehirns durchzuführen, indem gleichzeitig Dutzende von Schnitten mit dem SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen R etrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) Gewebetransformationsprotokoll verarbeitet werden, das die Klärung, Markierung und sequenzielle Bildgebungder Proben mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht. SHORT ermöglicht eine schnelle Gewebereinigung und homogene Mehrfachmarkierung dicker Schichten mit mehreren neuronalen Markern und ermöglicht so die Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz. Nach der Säuberung werden die Schichten über LSFM mit Mikrometerauflösung und in mehreren Kanälen gleichzeitig für eine schnelle 3D-Rekonstruktion abgebildet. Durch die Kombination von SHORT mit LSFM-Analyse innerhalb eines routinemäßigen Hochdurchsatzprotokolls ist es möglich, die 3D-Zytoarchitektur-Rekonstruktion großer volumetrischer Areale mit hoher Auflösung in kurzer Zeit zu erhalten und so eine umfassende strukturelle Charakterisierung des menschlichen Gehirns zu ermöglichen.
Introduction
Die Analyse der molekularen 3D-Organisation und Zytoarchitektur großer Volumina des menschlichen Gehirns erfordert eine optische Transparenz der Proben, die durch Protokolle mit langer Verarbeitungszeit erreicht wird. Optische Clearing-Techniken wurden entwickelt, um die Heterogenität des Brechungsindex (RI) innerhalb des Gewebes zu minimieren, wodurch die Lichtstreuung reduziert und die Lichteindringtiefe für hochauflösende Bildgebung erhöhtwird 1,2,3,4,5. Derzeitige Fortschritte bei der Klärung und der Markierung von tiefem Gewebe ermöglichen die volumetrische Bildgebung intakter Nagetierorgane und -embryonen unter Nutzung modernster Mikroskopietechniken 6,7,8,9,10,11,12.
Die volumetrische 3D-Rekonstruktion großer Bereiche des postmortalen menschlichen Gehirns stellt im Vergleich zu Modellorganismen jedoch noch eine herausfordernde Aufgabe dar. Die komplexe biologische Zusammensetzung und die variablen postmortalen Fixierungs- und Lagerbedingungen können die Effizienz der Gewebereinigung, die Eindringtiefe der Antikörper und die Epitoperkennung beeinträchtigen 13,14,15,16,17,18,19. Darüber hinaus ist immer noch ein mechanischer Gewebeschnitt und die anschließende Klärung und Markierung jeder einzelnen Scheibe erforderlich, um eine effiziente Klärung und gleichmäßige Markierung großer menschlicher Gehirnareale zu erreichen, was im Vergleich zu Modellorganismen zu langen Bearbeitungszeiten und dem Bedarf an ausgeklügelten kundenspezifischen Geräten führt 15,20,21,22.
Die S WITCH – H2O2 – Antigen Retrieval –TDE (SHORT) Gewebetransformationstechnik wurde speziell für die Analyse großer Volumina des menschlichen Gehirns entwickelt18,23. Diese Methode nutzt die Gewebestrukturkonservierung des SWITCH-Protokolls11 und hohe Konzentrationen von Peroxidwasserstoff, um die Autofluoreszenz des Gewebes in Kombination mit der Epitopwiederherstellung zu verringern. SHORT ermöglicht eine gleichmäßige Färbung menschlicher Hirnschnitte mit Markern für verschiedene neuronale Subtypen, Gliazellen, Gefäße und myelinisierte Fasern18,24. Die Ergebnisse sind mit der Analyse von Proteinen mit niedriger und hoher Dichte kompatibel. Die daraus resultierende hohe Transparenz und gleichmäßige Markierung ermöglichen die volumetrische Rekonstruktion dicker Schichten mit Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für die schnelle Erfassung können Lichtblattapparaturen verwendet werden 18,24,25,26,27.
In dieser Arbeit beschreiben wir, wie die SHORT-Gewebetransformationstechnik für die gleichzeitige Klärung und mehrstufige Markierung von Dutzenden von formalinfixierten menschlichen Hirnschnitten verwendet werden kann. Vier verschiedene fluoreszierende Marker können zusammen verwendet werden, was zur Identifizierung verschiedener zellulärer Subpopulationen führt. Nach der Klärung kann eine hochauflösende volumetrische Bildgebung mit Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Hier haben wir ein speziell angefertigtes invertiertes LSFM 18,24,25,26,27 verwendet, das ein schnelles optisches Schneiden der Probe und eine schnelle parallele Erfassung mehrerer Kanäle ermöglicht. Mit diesem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll ist es möglich, eine umfassende zelluläre und strukturelle Charakterisierung mit einer subzellulären Auflösung großer Bereiche des menschlichen Gehirns zu erhalten, wie bereits in der Kartierung eines gesamten Broca-Arealsgezeigt wurde 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hochauflösende Bildgebung und 3D-Rekonstruktion großer menschlicher Hirnareale erfordern mechanische Gewebeschnitte, gefolgt von optischer Klärung und Immunmarkierung einzelner Schichten. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die SHORT-Gewebetransformationsmethode für die schnelle und gleichzeitige Verarbeitung mehrerer menschlicher Hirndickschnitte für die 3D-Hirnrekonstruktion mit subzellulärer Auflösung mit LSFM verwendet werden kann.
Im Gegensatz zu anderen Ansätzen sind …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radioology, für die Bereitstellung der in dieser Studie analysierten menschlichen Gehirnproben. Dieses Projekt wurde gefördert durch das Forschungs- und Innovationsrahmenprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 654148 (Laserlab-Europe), aus dem Horizon 2020-Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung und Innovation im Rahmen der spezifischen Finanzhilfevereinbarungen Nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) und Nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), vom General Hospital Corporation Center der National Institutes of Health unter der Fördernummer U01 MH117023, und vom italienischen Bildungsministerium im Rahmen des italienischen Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-Forschungsinfrastruktur). Schließlich wurde diese Forschung mit Unterstützung der “Fondazione CR Firenze” durchgeführt. Der Inhalt dieser Arbeit liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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