Summary

Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.

Abstract

La colonne vertébrale définit un vertébré et façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière. Le bon développement et le bon fonctionnement du système nerveux central des mammifères dépendent en grande partie de l’activité des macrophages résidents connus sous le nom de microglies. Les microglies présentent une hétérogénéité et une multifonctionnalité, permettant une expression et un comportement géniques distincts dans la moelle épinière et le cerveau. De nombreuses études ont exploré la fonction de la microglie cérébrale, détaillant abondamment les méthodes de purification. Cependant, la purification de la microglie de la moelle épinière chez la souris manque d’une description complète. En revanche, l’utilisation d’une collagénase hautement purifiée, par opposition à un extrait non raffiné, manque de rapports dans les tissus du système nerveux central. Dans cette étude, la colonne vertébrale et la moelle épinière ont été excisées chez des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. La digestion subséquente a utilisé une collagénase hautement purifiée, et la purification de la microglie a utilisé un gradient de densité. Les cellules ont subi une coloration pour la cytométrie en flux, évaluant la viabilité et la pureté par coloration CD11b et CD45. Les résultats ont donné une viabilité moyenne de 80 % et une pureté moyenne de 95 %. En conclusion, la manipulation de la microglie de souris a impliqué une digestion avec une collagénase hautement purifiée, suivie d’un gradient de densité. Cette approche a effectivement produit d’importantes populations de microglies de la moelle épinière.

Introduction

La caractéristique déterminante des vertébrés est la colonne vertébrale ou colonne vertébrale, dans laquelle la notochorde a été remplacée par une séquence d’os segmentés appelés vertèbres, divisés par des disques intervertébraux. Cette succession de matière osseuse façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière1. Dans le genre Rodentia, la colonne vertébrale est généralement formée de sept vertèbres cervicales, treize vertèbres thoraciques, six vertèbres lombaires et un nombre variable de vertèbres caudales 2,3. La longueur de la moelle épinière est similaire à celle de la colonne vertébrale et le filum terminal est une structure non nerveuse qui ancre la moelle épinière au sacrum. De plus, les fibres nerveuses sortent par le foramen intervertébral1.

Le développement et le bon fonctionnement du système nerveux central chez les mammifères dépendent de manière critique de l’activité des macrophages résidents du système nerveux, appelés microglie4. Bien que les microglies aient été initialement décrites comme des phagocytes résidents du cerveau, des recherches récentes ont attribué de nombreuses fonctions dynamiques à ces cellules 5,6. La taille de la microglie varie de 7 à 10 μm en homéostasie ; Elles sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme et peuvent s’adapter morphologiquement et fonctionnellement à leur environnement en constante évolution7. Ces cellules présentent une forte hétérogénéité au stade embryonnaire et au stade adulte8,9, tandis qu’au stade adulte, elles présentent également une hétérogénéité fonctionnelle complexe en fonction de leur contexte spatio-temporel10. L’hétérogénéité et les multiples fonctions de la microglie permettent une expression et un comportement différentiels des gènes dans la moelle épinière et le cerveau. Il a été démontré que l’expression de CD11b, CD45, CD86 et CCR9 est plus élevée dans la moelle épinière que dans le cerveau 8,9.

Il existe plusieurs protocoles pour l’isolement de la microglie cérébrale11,12 ; cependant, il n’en existe que quelques-uns pour la microglie de la moelle épinière13,14. L’optimisation d’une méthode de purification de la microglie de la moelle épinière facilite le développement de multiples études axées sur la découverte de la physiologie de la microglie. Ce protocole vise à décrire une extraction simple et hautement reproductible de la moelle épinière de souris et la purification de la microglie (Figure 1).

Protocol

L’étude a été menée conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999 et au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’approbation de l’étude a été obtenue auprès des comités de recherche, d’éthique et de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Mexico (HIM/2023/006) et du comité de recherche et de bioéthique de l’hôpital général de Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trois souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines ont été obtenues de l’hôpit…

Representative Results

En utilisant du tissu de moelle épinière de souris, la digestion enzymatique a été réalisée à l’aide d’un mélange hautement enrichi en collagénase et en thermolysine. Le tissu digéré qui en résulte passe à travers un filtre de 40 μm pour éliminer les matières non digérées. Les cellules collectées ont été enrichies par un gradient de densité de Percoll, avec 90 % dans la partie inférieure et 45 % dans la partie supérieure. Les cellules enrichies en microglie à l’intérieur de l’interface o…

Discussion

De nombreux protocoles ont été développés pour l’étude de la microglie en raison de leur importance dans l’homéostasie cérébrale. Dans ces méthodes, les microglies proviennent généralement des hémisphères cérébraux de rats et de souris embryonnaires ou néonatals17. Un nombre limité d’études ont porté sur la purification de la microglie de la moelle épinière de souris adultes13,14. Ces techniques impliquent une di…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la bourse accordée par le Conseil national de la science et de la technologie (CONACYT) (702361). Les auteurs reconnaissent le programme de doctorat en sciences biologiques et chimiques de l’École nationale des sciences biologiques de l’Institut national polytechnique.

Materials

15 mL collection tubes Corning, USA 430790
2 mL microtubes Axygen, USA MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR BioLegend, USA 101302
50 mL collection tubes Corning, USA 430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) Gibco, USA 15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse eBioscience, USA 48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse   BioLegend, USA 103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free Corning, USA 46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm Corning, USA 352340
Costar 6-well Clear Not Treated  Corning, USA CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath  Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA 88870001
Dissecting forceps for microsurgery FT by DUMONT
DNase Roche, USA 4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)  Merck, USA D6429
Electric shaver
FACS tube Thermo, USA 352058
Fetal bovine serum (FBS) PAN Biotech, Alemania P30-3306
Flow cytometer Cytoflex  Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution  Merck, USA H2387
L-glutamine Corning, USA  15393631
Liberase TM  Roche, USA 5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers China 1103
Pentobarbital
Percoll  Merck, USA 17089101 density gradient centrifugation 
Poly-L-lysine solution  Merck, USA P8920
Scalpel No. 25  HERGOM, Mexico H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL Axygen, USA 10011-680
Stereoscopic microscope Velab, Mexico HG927831
Straight surgical scissors (10 cm) HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors HERGOM, Mexico
Triton X100 Merck, USA X100
Trypan blue Stain 0.4%  Merck, USA 15250-061
Vortex mixer DLAB, China 8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend, USA 423102 amine-reactive fluorescent dye staining 

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Citer Cet Article
Gutiérrez-Román, C. I., Meléndez Camargo, M. E., García Rojas, C. C., Jimenez Olvera, M., Gutiérrez Román, S. H., Medina-Contreras, O. Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65961, doi:10.3791/65961 (2023).

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