活小鼠精子顶体钙动力学和胞吐作用的实时成像
Summary
这里描述的AcroSensE小鼠模型和活细胞成像方法为研究精子顶体亚细胞区室中的钙动力学以及它们如何调节导致膜融合和顶体胞吐作用的中间步骤提供了一种新方法。
Abstract
顶体胞吐作用 （AE） 是精子的单个胞吐囊泡与质膜融合，是一个复杂的、依赖钙的过程，对受精至关重要。然而，我们对钙信号转导如何调节 AE 的理解仍然不完整。特别是，顶体内钙动力学与导致 AE 的中间步骤之间的相互作用尚不明确。在这里，我们描述了一种方法，该方法提供了对顶体钙动力学及其与膜融合和随后顶体囊泡胞吐作用的关系的空间和时间见解。该方法利用一种新型转基因小鼠，表达顶体靶向胞吐传感器（AcroSensE）。该传感器结合了与 mCherry 融合的基因编码钙指示剂 （GCaMP）。这种融合蛋白专门设计用于同时观察顶体钙动力学和膜融合事件。实时监测活体 AcroSensE 精子中的顶体钙动力学和 AE 是使用高帧率成像和可靶向单个精子的兴奋剂递送系统实现的。该协议还提供了几个用于量化和分析原始数据的基本方法示例。由于 AcroSensE 模型是基因编码的，因此可以通过使用现成的遗传工具（例如与其他小鼠遗传模型杂交或基于基因编辑 （CRISPR） 的方法）来增强其科学意义。通过这种策略，可以解决其他信号通路在精子获能和受精中的作用。总之，这里描述的方法提供了一种方便有效的工具来研究特定亚细胞区室（精子顶体）中的钙动力学，以及这些动力学如何调节导致膜融合和顶体胞吐作用的中间步骤。
Introduction
精子在称为获能1 的过程中获得受精能力。这个过程的一个终点是精子获得经历AE的能力。超过二十年的数据支持哺乳动物精子中存在复杂的多步骤AE模型（总结于2,3）。然而，研究活精子中的AE具有挑战性，目前可用的以足够分辨率监测这一过程的方法很麻烦，需要多个制备步骤4，仅限于检测AE的最后一步（例如，使用PNA5），仅限于测量胞质钙的变化（与顶体钙动力学相反）， 或仅限于细胞溶质钙动力学或 AE6 的测量。
为了克服生理条件下实时AE研究的一些关键局限性，并能够研究钙动力学和AE之间的相互作用，生成了一个独特的小鼠模型。在该小鼠模型中，由基因编码的 Ca2+ 传感器 （GCaMP3） 和 mCherry 组成的融合蛋白被表达并使用 acrosin 启动子和信号转导肽2 靶向顶体。靶向双GCaMP3-mCherry传感器能够使用显微镜和单细胞兴奋剂递送系统，在生理条件下同时实时测量活精子中的钙浓度和顶体内容物状态（图1）。作为顶体基质的一个组成部分，膜融合和 AE 将导致精子中光稳定和 pH 不敏感的 mCherry 荧光丢失，因为这种蛋白质从顶体囊泡中扩散出来。在这方面，该模型反映AE的时间和发生的能力类似于顶体靶向GFP小鼠系7,8,9的益处。
该转基因小鼠品系中使用的 GCaMP3 变体的 KD 约为 400 μM，Ca2+ 的动态范围为 10-4-10-3 M10，适用于该囊泡。我们发现，GCaMP3 的这种特征组合可以揭示质膜和顶体外膜 （OAM） 之间的融合孔形成2。融合孔检测是由于孔径太小而无法使 AcroSensE 蛋白从顶体中分散出来（通过顶体内容物丢失），同时提供膜“通道”，使 Ca2+ 离子能够流入顶体腔，导致 GCaMP3 的荧光强度增加。
明亮的、单体的、非钙敏感的荧光蛋白mCherry支持顶体的可视化，而GCaMP3信号微弱（例如，在Ca2+ 结合之前， 图2），重要的是，它还允许识别适合成像的顶体完整精子细胞。
以下协议描述了独特的AcroSensE小鼠模型的利用以及实验中使用的显微镜方法，以高空间和时间分辨率研究AE和精子钙动力学。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，描述了一种基于显微镜的方法，利用新生成的 AcroSensE 小鼠模型进行实时单细胞监测和分析顶体钙动力学与导致 AE 的中间步骤之间的相互作用。与现成的遗传方法（例如与其他小鼠遗传模型杂交或基因编辑）一起，该模型和方法提供了一个强大的系统来研究参与与获能、AE 和受精相关的精子信号通路的各种成分和途径的作用。
关键步骤
在所有精子处?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01-HD093827和R03-HD090304（AJT）的支持。
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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