लाइव माउस शुक्राणु में एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एक्सोसाइटोसिस की वास्तविक समय इमेजिंग
Summary
AcroSensE माउस मॉडल और लाइव सेल इमेजिंग विधियों यहाँ वर्णित शुक्राणु एक्रोसोम के उपकोशिकीय डिब्बे में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और कैसे वे झिल्ली संलयन और एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस के लिए अग्रणी मध्यवर्ती चरणों को विनियमित करते हैं।
Abstract
एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस (एई), जिसमें शुक्राणु का एकल एक्सोसाइटोटिक पुटिका प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ होता है, निषेचन के लिए आवश्यक एक जटिल, कैल्शियम-निर्भर प्रक्रिया है। हालांकि, कैल्शियम सिग्नलिंग एई को कैसे नियंत्रित करता है, इसकी हमारी समझ अभी भी अधूरी है। विशेष रूप से, इंट्रा-एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एई की ओर जाने वाले मध्यवर्ती चरणों के बीच परस्पर क्रिया अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। यहां, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता में स्थानिक और लौकिक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है और झिल्ली संलयन और एक्रोसोम पुटिका के बाद के एक्सोसाइटोसिस के साथ उनका संबंध है। विधि एक्सोसाइटोसिस (AcroSensE) के लिए एक एक्रोसोम-लक्षित सेंसर व्यक्त करने वाले एक उपन्यास ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग करती है। सेंसर mCherry के साथ जुड़े आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (GCaMP) को जोड़ता है। इस संलयन प्रोटीन विशेष रूप से एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और झिल्ली संलयन घटनाओं के समवर्ती अवलोकन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। लाइव AcroSensE शुक्राणु में एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एई की वास्तविक समय की निगरानी उच्च फ्रेम-दर इमेजिंग और एक उत्तेजक वितरण प्रणाली के संयोजन का उपयोग करके प्राप्त की जाती है जो एकल शुक्राणु को लक्षित कर सकती है। यह प्रोटोकॉल कच्चे डेटा की मात्रा निर्धारित करने और विश्लेषण करने के लिए बुनियादी तरीकों के कई उदाहरण भी प्रदान करता है। क्योंकि AcroSensE मॉडल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड है, इसके वैज्ञानिक महत्व को आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि अन्य माउस आनुवंशिक मॉडल या जीन-संपादन (CRISPR) आधारित विधियों के साथ क्रॉसब्रेडिंग। इस रणनीति के साथ, शुक्राणु क्षमता और निषेचन में अतिरिक्त सिग्नलिंग मार्गों की भूमिकाओं को हल किया जा सकता है। सारांश में, यहां वर्णित विधि एक विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बे में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और प्रभावी उपकरण प्रदान करती है-शुक्राणु एक्रोसोम-और कैसे उन गतिशीलता झिल्ली संलयन और एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस के लिए मध्यवर्ती चरणों को नियंत्रित करती है।
Introduction
शुक्राणु कैपेसिटेशन नामक प्रक्रिया के दौरान निषेचन करने की क्षमता प्राप्त करते हैं1. इस प्रक्रिया का एक समापन बिंदु यह है कि शुक्राणु एई से गुजरने की क्षमता प्राप्त करता है। दो दशकों से अधिक डेटा स्तनधारी शुक्राणु (2,3 में संक्षेपित) में एई के एक जटिल, बहु-चरण मॉडल की उपस्थिति का समर्थन करता है। हालांकि, जीवित शुक्राणु में एई का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है, और वर्तमान में पर्याप्त संकल्प के साथ इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए उपलब्ध तरीके बोझिल हैं और कई तैयारी चरणों की आवश्यकता होती है4, एई के अंतिम चरण का पता लगाने तक सीमित हैं (उदाहरण के लिए, पीएनए5 का उपयोग करके), साइटोसोलिक कैल्शियम में परिवर्तन के माप तक सीमित हैं (एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता के विपरीत), या या तो साइटोसोलिक कैल्शियम गतिशीलता या एई6 के माप तक सीमित हैं।
शारीरिक परिस्थितियों में वास्तविक समय एई अध्ययन की कुछ प्रमुख सीमाओं को दूर करने के लिए और कैल्शियम गतिशीलता और एई के बीच परस्पर क्रिया की जांच को सक्षम करने के लिए, एक अद्वितीय माउस मॉडल उत्पन्न किया गया था। इस माउस मॉडल में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड Ca2+-सेंसर (GCaMP3) और mCherry से बना एक फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त किया जाता है और एक्रोसिन प्रमोटर और सिग्नलिंग पेप्टाइड2 का उपयोग करके एक्रोसोम को लक्षित किया जाता है। लक्षित दोहरी GCaMP3-mCherry सेंसर कैल्शियम सांद्रता के एक साथ वास्तविक समय माप और माइक्रोस्कोपी और एक एकल कोशिका उत्तेजक वितरण प्रणाली(चित्रा 1)का उपयोग कर शारीरिक परिस्थितियों में जीवित शुक्राणु में एक्रोसोमल सामग्री की स्थिति को सक्षम बनाता है। एक्रोसोमल मैट्रिक्स, झिल्ली संलयन और एई के एक घटक के रूप में शुक्राणु से फोटोटेबल और पीएच-असंवेदनशील एमचेरी प्रतिदीप्ति का नुकसान होगा, क्योंकि यह प्रोटीन एक्रोसोम पुटिका से बाहर फैलता है। इस संबंध में, एई के समय और घटना को प्रतिबिंबित करने के लिए मॉडल की क्षमता एक्रोसोम-लक्षित जीएफपी माउस लाइन 7,8,9 के लाभों के समान है।
इस ट्रांसजेनिक माउस लाइन में उपयोग किए जाने वाले GCaMP3 संस्करण में 400 माइक्रोन का अनुमानित KD और Ca2+ के लिए 10-4-10-3 M10 की गतिशील रेंज है, जो इस पुटिका के लिए उपयुक्त है। हमने दिखाया कि GCaMP3 की विशेषताओं का यह संयोजन प्लाज्मा झिल्ली और बाहरी एक्रोसोमल झिल्ली (OAM)2के बीच संलयन ताकना गठन को प्रकट कर सकता है। फ्यूजन पोर डिटेक्शन ताकना आकार का एक परिणाम है जो AcroSensE प्रोटीन को एक्रोसोम (एक्रोसोम सामग्री के नुकसान के माध्यम से) से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए बहुत छोटा है, जबकि एक झिल्ली “चैनल” प्रदान करता है जो Ca2+ आयनों की आमद को एक्रोसोम लुमेन में सक्षम बनाता है, जिससे GCaMP3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होती है।
उज्ज्वल, मोनोमेरिक, गैर-कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry एक्रोसोम के दृश्य का समर्थन करता है, जबकि GCaMP3 सिग्नल बेहोश है (उदाहरण के लिए, सीए2+ बाध्यकारी, चित्रा 2 से पहले), और महत्वपूर्ण बात यह है कि यह इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक्रोसोम-बरकरार शुक्राणु कोशिकाओं की पहचान के लिए भी अनुमति देता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल अद्वितीय AcroSensE माउस मॉडल के उपयोग और उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ एई और शुक्राणु कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक रूप से इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी के लिए तरीकों का वर्णन करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, एक माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि को वास्तविक समय, एकल-सेल निगरानी और एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एई के लिए अग्रणी मध्यवर्ती चरणों के बीच परस्पर क्रिया के विश्लेषण के लिए नव उत्पन्न AcroSensE माउस मॉडल …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम स्वास्थ्य अनुदान R01-HD093827 और R03-HD090304 (एजेटी) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
