生きたマウス精子における先体カルシウム動態とエキソサイトーシスのリアルタイムイメージング
Summary
ここで説明するAcroSensEマウスモデルおよび生細胞イメージング法は、精子先体細胞の細胞内コンパートメントにおけるカルシウム動態と、それらが膜融合および先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように制御するかを研究するための新しいアプローチを提供します。
Abstract
精子の単一のエキソサイトーシス小胞が原形質膜と融合する先体エキソサイトーシス(AE)は、受精に不可欠な複雑なカルシウム依存プロセスです。しかし、カルシウムシグナル伝達がどのようにAEを調節するかについての理解はまだ不完全です。特に、先体内カルシウム動態とAEに至る中間段階との相互作用は明確に定義されていません。ここでは、先体カルシウムの動態と、膜融合とその後の先体小胞のエキソサイトーシスとの関係について、空間的および時間的な洞察を提供する方法について説明します。この方法では、アクロソーム標的エキソサイトーシス用センサー(AcroSensE)を発現する新しいトランスジェニックマウスを利用します。このセンサーは、mCherryと融合した遺伝子コードカルシウムインジケーター(GCaMP)を組み合わせています。この融合タンパク質は、アクロソームカルシウム動態と膜融合イベントを同時に観察できるように特別に設計されました。生きたAcroSensE精子の先体カルシウム動態とAEのリアルタイムモニタリングは、高フレームレートイメージングと単一の精子を標的とする刺激剤送達システムの組み合わせを使用して達成されます。このプロトコルは、生データを定量化および分析するための基本的な方法の例もいくつか提供します。AcroSensEモデルは遺伝子コードされているため、他のマウス遺伝子モデルとの交配や遺伝子編集(CRISPR)ベースの方法など、すぐに利用できる遺伝ツールを使用することで、その科学的重要性を高めることができます。この戦略により、精子の受精と受精における追加のシグナル伝達経路の役割を解決できます。要約すると、ここで説明する方法は、特定の細胞内コンパートメント(精子先体)のカルシウム動態と、それらの動態が膜融合と先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように調節するかを研究するための便利で効果的なツールを提供します。
Introduction
精子は、受精能力1と呼ばれるプロセス中に受精する能力を獲得します。このプロセスの1つのエンドポイントは、精子がAEを受ける能力を獲得することです。20年以上にわたるデータは、哺乳類の精子におけるAEの複雑で多段階的なモデルの存在を支持しています(2,3に要約)。しかしながら、生精子におけるAEの研究は困難であり、このプロセスを適切な分解能でモニターするために現在利用可能な方法は、煩雑であり、複数の調製ステップ4を必要とし、AEの最終ステップの検出に限定され(例えば、PNA5を使用)、細胞質カルシウムの変化の測定に限定される(先体カルシウム動態とは対照的に)、 または、細胞質カルシウム動態または AE6 のいずれかの測定に限定されます。
生理学的条件下でのリアルタイムAE研究のいくつかの重要な制限を克服し、カルシウム動態とAEの相互作用の調査を可能にするために、独自のマウスモデルを作成しました。このマウスモデルでは、遺伝的にコードされたCa2+センサー(GCaMP3)とmCherryからなる融合タンパク質が発現し、アクロシンプロモーターとシグナル伝達ペプチド2を用いて先体に標的化されます。ターゲットデュアルGCaMP3-mCherryセンサーは、顕微鏡検査と単一細胞刺激剤送達システムを使用して、生理学的条件下で生精子中のカルシウム濃度と先体内容物の状態を同時にリアルタイムに測定することを可能にします(図1)。アクロソームマトリックスの成分として、膜融合、およびAEは、このタンパク質が先体小胞から拡散するため、精子からの光安定性とpH非感受性のないmCherry蛍光の損失をもたらします。この点で、AEのタイミングと発生を反映するモデルの能力は、先体標的GFPマウス系統の利点に類似しています7,8,9。
このトランスジェニックマウス系統で用いられているGCaMP3変異体は、KDが約400μMで、Ca2+のダイナミックレンジが10-4-10-3 M 10であり、この小胞に適している。我々は、GCaMP3の特徴の組み合わせにより、原形質膜と外先体膜(OAM)2の間の融合孔形成を明らかにすることができることを示しました。融合細孔の検出は、細孔径が小さすぎてAcroSensEタンパク質が先体外に分散し(先体含有量の喪失を介して)、Ca2+イオンの先体内腔への流入を可能にする膜「チャネル」を提供し、GCaMP3の蛍光強度を増加させる結果です。
明るく、単量体で、カルシウム感受性のない蛍光タンパク質mCherryは、GCaMP3シグナルが微弱な間(例えば、Ca2+ 結合前、 図2)の先体可視化をサポートし、重要なことに、イメージングに適した先体無傷の精子細胞の同定も可能にします。
以下のプロトコルでは、独自のAcroSensEマウスモデルの利用と、高い空間分解能と時間分解能でAEおよび精子カルシウムの動態を研究するために実験的に使用された顕微鏡検査法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、新たに作製したAcroSensEマウスモデルを用いて、先体カルシウム動態とAEに至る中間ステップの相互作用をリアルタイムでシングルセルモニタリングおよび解析する顕微鏡ベースの手法について紹介します。このモデルと方法は、他のマウス遺伝子モデルとの交配や遺伝子編集など、容易に利用できる遺伝的アプローチとともに、受精、AE、および受精に関連する精子シグナル伝達経…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所の助成金R01-HD093827およびR03-HD090304(A.J.T.)の支援を受けました。
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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