Canlı fare sperminde akrozomal kalsiyum dinamiği ve ekzositozun gerçek zamanlı görüntülenmesi
Summary
Burada açıklanan AcroSensE fare modeli ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri, sperm akrozomunun hücre altı bölmesindeki kalsiyum dinamiklerini ve bunların membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar.
Abstract
Spermin tek ekzositik vezikülünün plazma zarı ile birleştiği akrozom ekzositozu (AE), döllenme için gerekli olan karmaşık, kalsiyuma bağımlı bir süreçtir. Bununla birlikte, kalsiyum sinyalinin AE’yi nasıl düzenlediğine dair anlayışımız hala eksiktir. Özellikle, intraakrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE’ye giden ara adımlar arasındaki etkileşim iyi tanımlanmamıştır. Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ve bunların membran füzyonu ve ardından akrozom vezikülünün ekzositozu ile ilişkisi hakkında uzamsal ve zamansal bilgiler sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, Ekzositoz için Akrozom hedefli bir Sensörü (AcroSensE) eksprese eden yeni bir transgenik fare kullanır. Sensör, mCherry ile kaynaşmış genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini (GCaMP) birleştirir. Bu füzyon proteini, akrozomal kalsiyum dinamiği ve membran füzyon olaylarının eşzamanlı gözlemini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Canlı AcroSensE sperminde akrozomal kalsiyum dinamiklerinin ve AE’nin gerçek zamanlı izlenmesi, yüksek kare hızlı görüntüleme ve tek spermi hedefleyebilen bir uyarıcı dağıtım sisteminin bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Bu protokol ayrıca ham verileri ölçmek ve analiz etmek için birkaç temel yöntem örneği sağlar. AcroSensE modeli genetik olarak kodlandığından, diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme (CRISPR) tabanlı yöntemler gibi hazır genetik araçlar kullanılarak bilimsel önemi artırılabilir. Bu strateji ile ek sinyal yolaklarının sperm kapasitasyonu ve döllenmedeki rolleri çözülebilir. Özetle, burada açıklanan yöntem, belirli bir hücre altı bölmedeki (sperm akrozomunda) kalsiyum dinamiklerini ve bu dinamiklerin membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için uygun ve etkili bir araç sağlar.
Introduction
Sperm, kapasitasyon1 adı verilen bir işlem sırasında döllenme yeteneği kazanır. Bu sürecin bir son noktası, spermin AE’ye girme yeteneğini kazanmasıdır. Yirmi yılı aşkın veriler, memeli sperminde karmaşık, çok adımlı bir AE modelinin varlığını desteklemektedir (2,3’te özetlenmiştir). Bununla birlikte, AE’yi canlı spermde incelemek zordur ve bu süreci yeterli çözünürlükle izlemek için şu anda mevcut olan yöntemler zahmetlidir ve birden fazla hazırlık adımı gerektirir4, AE’nin son adımının tespiti ile sınırlıdır (ör., PNA5 kullanılarak), sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin ölçümleri ile sınırlıdır (akrozomal kalsiyum dinamiklerinin aksine), veya sitozolik kalsiyum dinamiği veya AE6 ölçümleriyle sınırlıdır.
Fizyolojik koşullar altında gerçek zamanlı AE çalışmalarının bazı temel sınırlamalarının üstesinden gelmek ve kalsiyum dinamiği ile AE arasındaki etkileşimin araştırılmasını sağlamak için benzersiz bir fare modeli oluşturuldu. Bu fare modelinde, genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörü (GCaMP3) ve mCherry’den oluşan bir füzyon proteini eksprese edilir ve bir akrosin promotörü ve sinyal peptidi2 kullanılarak akrozoma hedeflenir. Hedeflenen çift GCaMP3-mCherry sensörü, mikroskopi ve tek hücreli uyarıcı dağıtım sistemi kullanılarak fizyolojik koşullar altında canlı spermdeki kalsiyum konsantrasyonlarının ve akrozomal içeriğin durumunun eş zamanlı gerçek zamanlı ölçümlerini sağlar (Şekil 1). Akrozomal matrisin bir bileşeni olarak, membran füzyonu ve AE, bu protein akrozom vezikülünden dışarı yayıldığından, spermden fototable ve pH’a duyarsız mCherry floresansının kaybına neden olur. Bu bağlamda, modelin AE’nin zamanlamasını ve oluşumunu yansıtma yeteneği, akrozom hedefli GFP fare serisi 7,8,9’un faydalarına benzer.
Bu transgenik fare serisinde kullanılan GCaMP3 varyantı, yaklaşık 400 μM’lik bir KD’ye ve bu vezikül için uygun olan 10-4-10-3 M 10’luk Ca2+ için dinamik bir aralığa sahiptir. GCaMP3’ün bu özellik kombinasyonunun, plazma membranı ile dış akrozomal membran (OAM)2 arasında füzyon gözenek oluşumunu ortaya çıkarabileceğini gösterdik. Füzyon gözenek tespiti, gözenek boyutunun AcroSensE proteininin akrozomdan dağılmasına izin vermeyecek kadar küçük olmasının bir sonucudur (akrozom içeriğinin kaybı yoluyla) ve Ca2+ iyonlarının akrozom lümenine akışını sağlayan bir membran “kanalı” sağlar, GCaMP3’ün floresan yoğunluğunda bir artışa yol açar.
Parlak, monomerik, kalsiyuma duyarlı olmayan floresan protein mCherry, GCaMP3 sinyali zayıfken (örneğin, Ca2+ bağlanmadan önce, Şekil 2) akrozomun görselleştirilmesini destekler ve daha da önemlisi, görüntüleme için uygun akrozom-bozulmamış sperm hücrelerinin tanımlanmasına da izin verir.
Aşağıdaki protokol, benzersiz AcroSensE fare modelinin kullanımını ve AE ve sperm kalsiyum dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle incelemek için deneysel olarak kullanılan mikroskopi yöntemlerini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE’ye yol açan ara adımlar arasındaki etkileşimin gerçek zamanlı, tek hücreli izlenmesi ve analizi için yeni oluşturulan AcroSensE fare modelini kullanmak için mikroskopi tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme gibi hazır genetik yaklaşımlarla birlikte, bu model ve yöntem, kapasitasyon, AE ve döllenme ile ilgili sperm sinyal yollarında yer alan çeşitli bileşenlerin ve yolların rolünü incelemek …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01-HD093827 ve R03-HD090304 (AJT) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
