यह प्रोटोकॉल पार्किंसंस रोग के अल्फा-सिंक्यूक्लिन आधारित ड्रोसोफिला मॉडल में कब्ज मॉडलिंग के लिए एक परख प्रस्तुत करता है।
पार्किंसंस रोग (पीडी) में गैर-मोटर लक्षण आम हैं, इलाज करना मुश्किल है, और जीवन की गुणवत्ता को काफी कम करता है। एक प्रचलित गैर-मोटर लक्षण कब्ज है, जो पीडी के निदान से पहले वर्षों या दशकों तक हो सकता है। पीडी के पशु मॉडल में कब्ज का पता नहीं लगाया गया है और विशिष्ट उपचारों का अभाव है। यह परख पीडी के ड्रोसोफिला मॉडल का उपयोग करता है जिसमें मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को पैन-न्यूरोनल ड्राइवर के तहत व्यक्त किया जाता है। अल्फा-सिंक्यूक्लिन व्यक्त करने वाली मक्खियाँ पीडी की पहचान विशेषताओं को विकसित करती हैं: डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, मोटर हानि और अल्फा-सिंक्यूक्लिन समावेशन का नुकसान।
यह प्रोटोकॉल इन मक्खियों में कब्ज का अध्ययन करने के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करता है। मक्खियों को रात भर नीले रंग के योज्य के साथ मक्खी के भोजन पर रखा जाता है और फिर अगले दिन मानक भोजन में स्थानांतरित कर दिया जाता है। बाद में उन्हें 8 घंटे के लिए हर घंटे मानक मक्खी भोजन के साथ नई शीशियों में ले जाया जाता है। प्रत्येक हस्तांतरण से पहले, शीशी की दीवार पर कुल फेकल स्पॉट की तुलना में नीले रंग के फेकल स्पॉट का प्रतिशत गणना की जाती है। नियंत्रण मक्खियों कि अल्फा-सिंक्यूक्लिन की कमी अल्फा-सिंक्यूक्लिन व्यक्त मक्खियों से पहले सभी नीले डाई घंटे निष्कासित कर दिया. इसके अतिरिक्त, आंत से नीले रंग के भोजन के पारित होने की निगरानी सरल फोटोग्राफी के साथ की जा सकती है। इस परख की सादगी ड्रोसोफिला में कब्ज के संशोधक की पहचान करने के लिए आगे आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन में इसके उपयोग को सक्षम बनाती है।
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो नैदानिक रूप से ब्रैडीकिनेसिया, कठोरता और कंपकंपी जैसे मोटर लक्षणों की उपस्थिति से विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण रुग्णता1. पैथोलॉजिकल रूप से, पीडी को पर्याप्त नाइग्रा में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान और अल्फा-सिंक्यूक्लिन के मिसफोल्डिंग से परिभाषित किया जाता है, जिससे लेवी निकायों और लेवी न्यूराइट्स का निर्माण होता है। पीडी के रोगजनन खराब समझा रहता है, संभावना आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों 2,3 की एक जटिल परस्पर क्रिया से उत्पन्न होती है. वर्तमान में, रोग-संशोधित उपचार अनुपलब्ध हैं, संभवतः निदान के समय मौजूद पैथोलॉजी के उन्नत चरण के कारण। अध्ययनों से पता चला है कि पर्याप्त नाइग्रा में 60% से अधिक डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पहले से ही मोटर लक्षणों की शुरुआत से खो चुके हैं, प्रारंभिक रोग का पता लगाने के लिए संभावित बायोमार्कर का पता लगाने की आवश्यकता को रेखांकित करते हैं4. ऐसा ही एक नैदानिक बायोमार्कर कब्ज है, जो पीडी रोगियोंमें आम है 5,6 और साल या यहां तक कि दशकों से मोटर लक्षण शुरुआत से पहले हो सकता है।
मोटर लक्षणों के आधार पर पीडी की नैदानिक परिभाषा के बावजूद, कब्ज कई गैर-मोटर लक्षणों में से एक है जो रोगसूचक रूप से इलाज करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हैं और रोगियोंके जीवन की गुणवत्ता में महत्वपूर्ण हानि का कारण बनते हैं। आंत-मस्तिष्क अक्ष में परिवर्तन, जो मस्तिष्क और एंटरिक तंत्रिका तंत्र के बीच द्विदिश संचार का प्रतिनिधित्व करता है, को पीडी रोगजनन में फंसाया गया है। अल्फा-सिंक्यूक्लिन समुच्चय पीडी रोगियों8 के जठरांत्र संबंधी मार्ग से ऊतक के नमूनों में पाए गए हैं, और पशु मॉडल का सुझाव है कि आंत्र तंत्रिका तंत्र में अल्फा-सिंक्यूक्लिन समुच्चय केंद्रीयतंत्रिका तंत्र 9 के लिए प्रियन की तरह तरीके से फैलता है। इसके साथ ही, पीडी रोगियों आंत माइक्रोबायोम10 में असामान्यताएं प्रदर्शित और अत्यधिक आंतसूजन 11 अनुभव हो सकता है. पीडी में कब्ज का अध्ययन किया गया है, मक्खियों 12,13 या कृन्तकों 14,15 में पार्किंसंस से जुड़े कब्ज के कुछ रिपोर्ट किए गए मॉडल के साथ।
यह परख पीडी के ड्रोसोफिला मॉडल को नियोजित करता है जिसमें मक्खियों ने पैन-न्यूरोनल ड्राइवर, एन-सिनैप्टोब्रेविन के नियंत्रण में मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन जीन को व्यक्त किया। इन मक्खियों पीडी के सभी बानगी सुविधाओं का प्रदर्शन, अल्फा सिंक्यूक्लिन एकत्रीकरण, मोटर शिथिलता, और उम्र से संबंधित neurodegeneration, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स16,17 के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप. पिछले अध्ययनों ने मक्खियों में फेकल आउटपुट के माप को आंत की शिथिलता का आकलन करने, फ्लाई फेकल पदार्थ की मात्रा निर्धारित करने और पाचन तंत्र 18,19,20में कार्यात्मक अंतर प्रकट करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक रेखाओं में मलमूत्र मात्रा की तुलना करने के लिए पेश किया है। यहां, हम मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली मक्खियों का उपयोग करके कब्ज परख का प्रदर्शन करते हैं। यह सरल लेकिन मूल्यवान उपकरण पीडी के एक महत्वपूर्ण गैर-मोटर लक्षण के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल में कई कदम हैं जो परख के सफल समापन में सहायता करेंगे। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक शीशी के लिए प्रत्येक दौर के बीच समय अंतराल प्रयोग भर में सुसंगत हैं. संख्याओं के साथ शीशियों को लेबल करने से समय की बचत, लंबे जीनोटाइप विवरण की आवश्यकता से बचने में मदद मिलेगी। इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि फेकल पदार्थ22 की गिनती के लिए विधि प्रयोग भर में सुसंगत रहता है. जबकि नीला फेकल पदार्थ भोजन और शीशी प्लग पर दिखाई देता है, रंगहीन फेकल पदार्थ नहीं होता है। इसलिए, भोजन या शीशी प्लग पर नीले बिंदुओं की गिनती न करें।
व्यवहार परख के साथ, परख को प्रभावित करने वाले मक्खी के व्यवहार या अज्ञात चर में उतार-चढ़ाव के कारण परिणामों में विसंगतियों की संभावना हमेशा होती है। हम सभी प्रयोगों के लिए एक ही ड्रोसोफिला मीडिया, एक ही खाद्य डाई और शीशियों के एक ही ब्रांड का उपयोग करने की सलाह देते हैं। दिलचस्प बात यह है कि कई परीक्षणों में, यह देखा गया कि मक्खियों की दोपहर में कम बार शौच करती हैं, संभवतः मक्खियों के सर्कैडियन लय23 के कारण। हालांकि, यह व्यवहार अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली नियंत्रण मक्खियों और मक्खियों दोनों में सुसंगत है, इसलिए इसे चिंताओं को नहीं उठाना चाहिए।
यदि मक्खियों परख की शुरुआत में नीले फेकल पदार्थ का उत्सर्जन नहीं करते हैं, तो संभव है कि इस्तेमाल की जाने वाली डाई पर्याप्त रंजित न हो। इस मामले में, कोई तदनुसार आसुत जल के लिए डाई के अनुपात को बढ़ा सकता है। यह भी संभव है कि जब मक्खी के पाचन तंत्र में केवल थोड़ी मात्रा में नीला भोजन बचा हो, तो यह निर्धारित करना मुश्किल हो सकता है कि फेकल पदार्थ हल्का नीला या रंगहीन है या नहीं। जब ऐसा होता है, तो शीशी के पीछे कागज की एक सफेद शीट रखने से फेकल डॉट के रंग को निर्धारित करने में मदद मिलेगी। यहां तक कि अगर फेकल पदार्थ बहुत हल्का नीला है, तो इसे रंगहीन फेकल पदार्थ के बजाय नीले फेकल पदार्थ के रूप में रिकॉर्ड करना सबसे अच्छा है।
इस परख की एक सीमा यह है कि यह fecal धब्बे की मैनुअल गिनती की आवश्यकता है. उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की क्षमता में सुधार करने के लिए, इस प्रोटोकॉल को भविष्य में संशोधित किया जा सकता है ताकि बहु-अच्छी प्लेटों में व्यक्तिगत मक्खियों द्वारा उत्पादित नीले फेकल स्पॉट के स्वचालित परिमाणीकरण की अनुमति मिल सके। एक और सीमा यह है कि, हालांकि अल्फा-सिंक्यूक्लिन मॉडल में पीडी के एक प्रोड्रोमल मॉडल में विकसित होने की क्षमता है, एक इष्टतम समय बिंदु जिस पर न्यूरोडीजेनेरेशन के बिना कब्ज मौजूद है, अभी तक पहचाना नहीं गया है।
सारांश में, यह विधि पीडी के ड्रोसोफिला मॉडल में कब्ज, एक गैर-मोटर पीडी लक्षण, मॉडलिंग के लिए एक सरल, सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है।
The authors have nothing to disclose.
हम ड्रोसोफिला लाइनों को व्यक्त करने वाले नियंत्रण और अल्फा-सिंक्यूक्लिन के प्रकार के उपहार के लिए ब्रिघम और महिला अस्पताल और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में डॉ मेल फेनी को स्वीकार करते हैं। हम डॉ. ऑलसेन को अनुदान सहायता के निम्नलिखित स्रोतों को स्वीकार करते हैं: NINDS K08, अमेरिकन पार्किंसंस डिजीज एसोसिएशन जॉर्ज सी. कोटज़ियास फैलोशिप, डिपार्टमेंट ऑफ़ डिफेंस पार्किंसंस डिजीज अर्ली इन्वेस्टिगेटर अवार्ड।
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |