طريقة فعالة وسريعة لوضع العلامات وتحليل كبيبات الماوس
Summary
تقدم هذه الدراسة مجموعة سهلة الاستخدام وكاملة وبسيطة من الطرق لتسمية وتحليل الكبيبات من كليتي الفئران التي تم تطهيرها من CUBIC. يمكن الحصول على بيانات مثل رقم الكبيبة وحجمها بسهولة وموثوقية باستخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) -Dextran ، أو الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ، أو الفحص المجهري البؤري المشترك والبرامج مثل Imaris.
Abstract
الكبيبات هي وحدات أساسية في الكلى. ومن ثم ، فإن دراسة الكبيبات أمر محوري لفهم وظائف الكلى وعلم الأمراض. يوفر التصوير البيولوجي معلومات بديهية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تسمية الكبيبات ومراقبتها. ومع ذلك ، فإن طرق مراقبة الكبيبات المستخدمة حاليا تتطلب عمليات معقدة ، وقد تفقد النتائج تفاصيل التسمية أو المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). تم استخدام كوكتيلات تصوير الدماغ الواضحة والخالية من العوائق وتقنية مسح الأنسجة بالتحليل الحسابي (CUBIC) على نطاق واسع في أبحاث الكلى ، مما يسمح باكتشاف أكثر دقة وعمق اكتشاف أعمق. وجدنا أنه يمكن تمييز كبيبات الفئران بسرعة وفعالية عن طريق حقن الوريد الذيل للوزن الجزيئي المتوسط FITC-Dextran متبوعا بطريقة المقاصة المكعبة. يمكن مسح كلية الفأر التي تم تطهيرها بواسطة مجهر ضوئي (أو مجهر متحد البؤر عند تقطيعها) للحصول على أكوام صور ثلاثية الأبعاد لجميع الكبيبات في الكلية بأكملها. يمكن بسهولة رقمنة إشارات الكبيبات وتحليلها لقياس عدد الكبيبات وحجمها وتواترها.
Introduction
عدد وحجم الكبيبات مهمة جدا لتشخيص وعلاج أمراض الكلى المختلفة1،2،3،4،5. المعيار الذهبي لتقدير عدد الكبيبات هو تركيبة التشريح المادي / المجزأ. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة كواشف ومعدات خاصة ، مما يجعلها بطيئة ومكلفة6،7،8،9. توفر الخزعة ثروة من المعلومات ، ولكن من الواضح أن هذه الطريقة مناسبة فقط للتقديرات التقريبية10,11. كما تستخدم تقنيات التصوير الطبي ، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) والأشعة السينية ، على نطاق واسع في الكشف عن الكبيبات12،13،14،15 ، ولكن هذه التقنيات تتطلب أدوات ضخمة. كما استخدمت طرق جديدة ، مثل مطياف الكتلة التصويري16 للتصوير بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) أو طريقة المقطعالسميك والرقيق 17 ، في الكشف عن الكبيبات ، على الرغم من أنها لا تزال مملة وشاقة.
بمساعدة تقنيات الشفافية ، من الممكن مراقبة أعماق أعمق والحصول على معلومات أكثر ثراء واكتمالا من الأنسجة السميكة أو حتى الأعضاء الكاملة18،19،20،21،22،23. لذلك ، تم استخدام تقنيات الشفافية على نطاق واسع في أبحاث الكلى24. وتشارك أيضا مراقبة والكشف عن الكبيبات في الكلى تطهيرها. ومع ذلك ، فإن هذه المقالات المنشورة إما أشارت لفترة وجيزة فقط إلى الكشف عن الكبيبات25 أو استخدمت طرق وضع العلامات التي يصعب تحقيقها مثل المعدلة وراثيا26 ، أو الأصباغ المنتجة ذاتيا13 ، أو حضانة الأجسام المضادة عالية التركيز27 لتسمية الكبيبات. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الدراسات قد حللت الكبيبات في الكلى التي تم تطهيرها ، إلا أن التحليلات كانت دائما محدودة13 أو اعتمدت على خوارزميات التحليل التي أنشأها المؤلفون أنفسهم26.
لقد أظهرنا سابقا طريقة أكثر ملاءمة لتسمية الكبيبات في كلى الفئران28. باستخدام Imaris ، وجدنا أنه يمكن الحصول بسرعة على عدد الكبيبات وتكرارها وحجمها. وبالتالي ، نقدم هنا مجموعة من الطرق التي يسهل الوصول إليها وشمولية ومبسطة لتسمية وتحليل كبيبات كلى الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة إلى 3 أو 4 مجموعات29،30،31. تم تطبيق إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية (على سبيل المثال ، DISCO و PEGASOS) ، وتنظيف الأنسجة المائية (على سبيل المثال ، CUBIC) ، وتطهير الأنسجة بتضمين الهيدروجيل (على سبيل المثال ، …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204951) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
