Een efficiënte en snelle methode voor het labelen en analyseren van muizenglomeruli
Summary
Deze studie presenteert een gebruiksvriendelijke, complete en eenvoudige reeks methoden om glomeruli uit CUBIC-gezuiverde muizennieren te labelen en te analyseren. Gegevens zoals het aantal en het volume van de glomerulus kunnen eenvoudig en betrouwbaar worden verkregen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) of gewone confocale microscopie en software zoals Imaris.
Abstract
De glomeruli zijn fundamentele eenheden in de nier; Daarom is het bestuderen van de glomeruli cruciaal voor het begrijpen van de nierfunctie en pathologie. Biologische beeldvorming biedt intuïtieve informatie; Het is dus van groot belang om de glomeruli te labelen en te observeren. De glomeruli-waarnemingsmethoden die momenteel worden gebruikt, vereisen echter gecompliceerde bewerkingen en de resultaten kunnen labeldetails of driedimensionale (3D) informatie verliezen. De heldere, onbelemmerde hersenbeeldvormingscocktails en computationele analyse (CUBIC) weefselopruimingstechnologie is op grote schaal gebruikt in nieronderzoek, waardoor een nauwkeurigere detectie en een diepere detectiediepte mogelijk is. We ontdekten dat glomeruli van muizen snel en effectief kunnen worden geëtiketteerd door staartaderinjectie van FITC-Dextran met een gemiddeld molecuulgewicht, gevolgd door de CUBIC-opruimingsmethode. De geklaarde muizennier kan worden gescand door een lichtbladmicroscoop (of een confocale microscoop wanneer gesneden) om driedimensionale beeldstapels van alle glomeruli in de hele nier te verkrijgen. Verwerkt met de juiste software kunnen de glomeruli-signalen eenvoudig worden gedigitaliseerd en verder worden geanalyseerd om het aantal, het volume en de frequentie van de glomeruli te meten.
Introduction
Het aantal en het volume van glomeruli zijn erg belangrijk voor de diagnose en behandeling van verschillende nierziekten 1,2,3,4,5. De gouden standaard voor het schatten van glomeruli-getallen is de combinatie van fysieke dissector en fractionator. Deze methode vereist echter speciale reagentia en apparatuur, waardoor het traag en duuris 6,7,8,9. Biopsie levert een schat aan informatie op, maar uiteraard is deze methode alleen geschikt voor ruwe schattingen10,11. Medische beeldvormingstechnologieën, waaronder magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), computertomografie (CT) en röntgenfoto’s, worden ook veel gebruikt bij glomerulaire detectie 12,13,14,15, maar dergelijke technologieën vereisen omvangrijke instrumenten. Nieuwe methoden, zoals matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometer16 of de thick and thin section-methode17, zijn ook gebruikt bij glomerulaire detectie, hoewel ze vervelend en moeizaam blijven.
Met behulp van transparantietechnologieën is het mogelijk om diepere diepten waar te nemen en rijkere en completere informatie te verkrijgen uit dikke weefsels of zelfs hele organen 18,19,20,21,22,23. Daarom worden transparantietechnologieën op grote schaal gebruikt in nieronderzoek24. De observatie en detectie van glomeruli in de gezuiverde nieren zijn ook betrokken. Deze gepubliceerde artikelen verwezen echter slechts kort naar glomerulaire detectie25 of gebruikten moeilijk te bereiken etiketteringsmethoden zoals transgene dieren26, zelfgeproduceerde kleurstoffen13 of incubatie van antilichamen met hoge concentratie27 om de glomeruli te labelen. Bovendien, hoewel studies glomeruli in gezuiverde nieren hadden geanalyseerd, waren de analyses altijd beperkt13 of vertrouwden ze op analysealgoritmen die door de auteurs zelf waren opgesteld26.
We hebben eerder een handigere manier gedemonstreerd om de glomeruli in de nieren van muizen te labelen. Door Imaris te gebruiken, ontdekten we dat het aantal, de frequentie en het volume van glomeruli snel konden worden verkregen. Daarom presenteren we hier een meer toegankelijke, uitgebreide en vereenvoudigde reeks methoden om de glomeruli van muizennieren te labelen en te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Weefselreinigingstechnologieën kunnen worden ingedeeld in 3 of 4 groepen 29,30,31. Organische weefselzuivering op basis van oplosmiddelen (bijv. DISCO en PEGASOS), weefselreiniging op basis van water (bijv. CUBIC) en weefselopruiming met hydrogel (bijv. CLARITY) zijn allemaal toegepast bij het opruimen van nieren 25,26,28,32.</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82204951) en Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
