Eine effiziente und schnelle Methode zur Markierung und Analyse von Mausglomeruli
Summary
Diese Studie stellt eine einfach anzuwendende, vollständige und einfache Reihe von Methoden zur Markierung und Analyse von Glomeruli aus CUBIC-geräumten Mäusenieren vor. Daten wie Glomeruluszahl und -volumen können einfach und zuverlässig mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) oder gängiger konfokaler Mikroskopie und Software wie Imaris gewonnen werden.
Abstract
Die Glomeruli sind grundlegende Einheiten in der Niere; Daher ist die Untersuchung der Glomeruli von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Nierenfunktion und -pathologie. Die biologische Bildgebung liefert intuitive Informationen; Daher ist es von großer Bedeutung, die Glomeruli zu beschriften und zu beobachten. Die derzeit verwendeten Glomeruli-Beobachtungsmethoden erfordern jedoch komplizierte Operationen, und die Ergebnisse können Markierungsdetails oder dreidimensionale (3D) Informationen verlieren. Die klare, ungehinderte Brain-Imaging-Cocktails und die Computational Analysis (CUBIC)-Gewebereinigungstechnologie sind in der Nierenforschung weit verbreitet und ermöglichen eine genauere Detektion und eine tiefere Detektionstiefe. Wir fanden heraus, dass Maus-Glomeruli schnell und effektiv durch Schwanzveneninjektion von mittelmolekularem FITC-Dextran gefolgt von der CUBIC-Clearing-Methode markiert werden können. Die gereinigte Mausniere konnte mit einem Lichtblattmikroskop (oder einem konfokalen Mikroskop, wenn sie geschnitten wurde) gescannt werden, um dreidimensionale Bildstapel aller Glomeruli in der gesamten Niere zu erhalten. Mit entsprechender Software verarbeitet, konnten die Glomeruli-Signale leicht digitalisiert und weiter analysiert werden, um die Anzahl, das Volumen und die Frequenz der Glomeruli zu messen.
Introduction
Die Anzahl und das Volumen der Glomeruli sind sehr wichtig für die Diagnose und Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen 1,2,3,4,5. Der goldene Standard der Glomeruli-Zahlschätzung ist die Kombination aus physikalischem Dissektor und Fraktionierer. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Reagenzien und Geräte, was sie langsam und teuer macht 6,7,8,9. Die Biopsie liefert eine Fülle von Informationen, aber offensichtlich ist diese Methode nur für grobe Schätzungen geeignet10,11. Medizinische Bildgebungstechnologien, einschließlich Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) und Röntgen, sind ebenfalls bei der glomerulären Detektion weit verbreitet 12,13,14,15, aber solche Technologien erfordern sperrige Instrumente. Neue Methoden, wie z. B. das matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometer16 oder das Dick- und Dünnschliffverfahren17, wurden ebenfalls in der glomerulären Detektion eingesetzt, obwohl sie nach wie vor mühsam und mühsam sind.
Mit Hilfe von Transparenztechnologien ist es möglich, tiefere Tiefen zu beobachten und reichhaltigere und vollständigere Informationen aus dickem Gewebe oder sogar ganzen Organen zu erhalten 18,19,20,21,22,23. Daher sind Transparenztechnologien in der Nierenforschung weit verbreitet24. Auch die Beobachtung und der Nachweis von Glomeruli in den gereinigten Nieren gehören dazu. Diese veröffentlichten Artikel bezogen sich jedoch entweder nur kurz auf den glomerulären Nachweis25 oder verwendeten schwierig zu erreichende Markierungsmethoden wie transgene Tiere26, selbst hergestellte Farbstoffe13 oder hochkonzentrierte Antikörperinkubation27 zur Markierung der Glomeruli. Obwohl Studien Glomeruli in gereinigten Nieren analysiert hatten, waren die Analysen immer begrenzt13 oder stützten sich auf Analysealgorithmen, die von den Autoren selbst entwickelt wurden26.
Wir haben bereits einen bequemeren Weg zur Markierung der Glomeruli in den Nieren von Mäusen gezeigt28. Durch die Verwendung von Imaris stellten wir fest, dass die Anzahl, Häufigkeit und das Volumen der Glomeruli schnell ermittelt werden konnten. Daher stellen wir hier einen zugänglicheren, umfassenderen und vereinfachten Satz von Methoden zur Markierung und Analyse der Glomeruli von Mäusenieren vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tissue-Clearing-Technologien können in 3 oder 4 Gruppen eingeteiltwerden 29,30,31. Organisches Gewebe-Clearing auf Lösungsmittelbasis (z. B. DISCO und PEGASOS), Gewebe-Clearing auf wässriger Basis (z. B. CUBIC) und Hydrogel-einbettendes Gewebe-Clearing (z. B. CLARITY) wurden alle bei der Nierenreinigung angewendet 25,26,28,32.</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82204951) und des Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102) unterstützt.
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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