שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר
Summary
מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.
Abstract
הגלומרולי הן יחידות בסיסיות בכליה; לפיכך, לימוד הגלומרולי הוא חיוני להבנת תפקוד הכליות והפתולוגיה. הדמיה ביולוגית מספקת מידע אינטואיטיבי; לכן, יש משמעות רבה לתייג ולהתבונן גלומרולי. עם זאת, שיטות התצפית הגלומרוליות הנמצאות בשימוש כיום דורשות פעולות מסובכות, והתוצאות עלולות לאבד פרטי תווית או מידע תלת מימדי (תלת ממדי). הקוקטיילים הצלולים והבלתי מופרעים של דימות מוחי וניתוח חישובי (CUBIC) של טכנולוגיית ניקוי רקמות נמצאים בשימוש נרחב במחקר הכליות, ומאפשרים זיהוי מדויק יותר ועומק גילוי עמוק יותר. מצאנו כי גלומרולי עכבר יכול להיות מסומן במהירות וביעילות על ידי הזרקת ורידים זנב של משקל מולקולרי בינוני FITC-Dextran ואחריו שיטת ניקוי CUBIC. ניתן לסרוק את כליה העכבר המנוקה על ידי מיקרוסקופ אור (או מיקרוסקופ קונפוקלי כאשר פורסים) כדי לקבל ערימות תמונה תלת ממדיות של כל הגלומרולי בכליה כולה. מעובד עם תוכנה מתאימה, אותות glomeruli יכול להיות דיגיטלי בקלות ולנתח עוד יותר כדי למדוד את מספר, נפח, ותדירות של glomeruli.
Introduction
מספר ונפח glomeruli חשובים מאוד לאבחון וטיפול במחלות כליות שונות 1,2,3,4,5. תקן הזהב של הערכת מספר גלומרולי הוא שילוב הדיסקטור הפיזי / שבר. עם זאת, שיטה זו דורשת ריאגנטים מיוחדים וציוד, מה שהופך אותו איטי ויקר 6,7,8,9. ביופסיה מספקת שפע של מידע, אך ברור ששיטה זו מתאימה רק להערכות גסות10,11. טכנולוגיות הדמיה רפואית, כולל דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ורנטגן, נמצאות בשימוש נרחב גם בזיהוי גלומרולרי 12,13,14,15, אך טכנולוגיות כאלה דורשות מכשירים מגושמים. שיטות חדשות, כגון ספקטרומטר מסה16 (MALDI) או שיטת חתך עבה ודק17, שימשו גם בזיהוי גלומרולרי, אם כי הן נותרו מייגעות ומייגעות.
בעזרת טכנולוגיות שקיפות ניתן להתבונן לעומקים עמוקים יותר ולקבל מידע עשיר ושלם יותר מרקמות עבות או אפילו איברים שלמים 18,19,20,21,22,23. לכן, טכנולוגיות שקיפות היו בשימוש נרחב במחקר כליות24. התצפית והזיהוי של glomeruli בכליות מנוקות מעורבים גם. עם זאת, מאמרים אלה שפורסמו התייחסו רק בקצרה לזיהוי גלומרולרי25 או השתמשו בשיטות תיוג קשות להשגה כגון חיות טרנסגניות26, צבעים בייצור עצמי13, או דגירה נוגדנים בריכוז גבוה27 כדי לתייג את הגלומרולי. בנוסף, למרות שמחקרים ניתחו גלומרולי בכליות מנוקות, הניתוחים היו תמיד מוגבלים13 או הסתמכו על אלגוריתמי ניתוח שהוקמו על ידי המחברים עצמם26.
הדגמנו בעבר דרך נוחה יותר לתייג את הגלומרולי בעכברים כליות28. על ידי שימוש ב- Imaris, מצאנו כי ספירת גלומרולי, תדירות ונפח ניתן להשיג במהירות. לכן, כאן אנו מציגים קבוצה נגישה, מקיפה ופשוטה יותר של שיטות כדי לתייג ולנתח את glomeruli של כליות עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנולוגיות ניקוי רקמות ניתן לסווג 3 או 4 קבוצות 29,30,31. ניקוי רקמות אורגני מבוסס ממס (למשל, DISCO ופגסוס), ניקוי רקמות על בסיס מימי (למשל, CUBIC), וניקוי רקמות הטבעה הידרוג’ל (למשל, CLARITY) יושמו כולם בניקוי כליות 25,26,28,32.<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204951) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ’ואן (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
