माउस ग्लोमेरुली को लेबल करने और विश्लेषण करने के लिए एक कुशल और तेज़ तरीका
Summary
यह अध्ययन क्यूबिक-साफ़ माउस गुर्दे से ग्लोमेरुली को लेबल और विश्लेषण करने के तरीकों का एक आसान-से-उपयोग, पूर्ण और सरल सेट प्रस्तुत करता है। ग्लोमेरुलस संख्या और मात्रा जैसे डेटा को फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) -डेक्सट्रान, लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम), या सामान्य कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और सॉफ्टवेयर जैसे इमारिस का उपयोग करके आसानी से और मज़बूती से प्राप्त किया जा सकता है।
Abstract
ग्लोमेरुली गुर्दे में मौलिक इकाइयाँ हैं; इसलिए, ग्लोमेरुली का अध्ययन गुर्दे के कार्य और विकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। जैविक इमेजिंग सहज ज्ञान युक्त जानकारी प्रदान करता है; इस प्रकार, ग्लोमेरुली को लेबल करना और निरीक्षण करना बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि, वर्तमान में उपयोग में ग्लोमेरुली अवलोकन विधियों को जटिल संचालन की आवश्यकता होती है, और परिणाम लेबल विवरण या त्रि-आयामी (3 डी) जानकारी खो सकते हैं। स्पष्ट, अबाधित मस्तिष्क इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण (क्यूबीआईसी) ऊतक समाशोधन तकनीक का व्यापक रूप से गुर्दे के अनुसंधान में उपयोग किया गया है, जिससे अधिक सटीक पहचान और गहरी पहचान गहराई की अनुमति मिलती है। हमने पाया कि माउस ग्लोमेरुली को क्यूबिक क्लियरिंग विधि के बाद मध्यम आणविक भार FITC-Dextran के पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा तेजी से और प्रभावी ढंग से लेबल किया जा सकता है। साफ माउस गुर्दे पूरे गुर्दे में सभी ग्लोमेरुली के तीन आयामी छवि ढेर प्राप्त करने के लिए एक प्रकाश शीट खुर्दबीन (या कटा हुआ जब एक फोकल खुर्दबी) द्वारा स्कैन किया जा सकता है. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित, ग्लोमेरुली संकेतों को आसानी से डिजिटाइज़ किया जा सकता है और ग्लोमेरुली की संख्या, मात्रा और आवृत्ति को मापने के लिए आगे का विश्लेषण किया जा सकता है।
Introduction
विभिन्न गुर्देकी बीमारियों 1,2,3,4,5के निदान और उपचार के लिए ग्लोमेरुली की संख्या और मात्रा बहुत महत्वपूर्ण है। ग्लोमेरुली संख्या अनुमान का सुनहरा मानक भौतिक विच्छेदन / हालांकि, इस पद्धति के लिए विशेष अभिकर्मकों और उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिससे यह धीमा और महंगा 6,7,8,9 हो जाता है। बायोप्सी जानकारी का खजाना प्रदान करता है, लेकिन जाहिर है, इस विधि केवल किसी न किसी अनुमान10,11 के लिए उपयुक्त है. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), गणना टोमोग्राफी (सीटी), और एक्स-रे सहित चिकित्सा इमेजिंग प्रौद्योगिकियां, ग्लोमेरुलर डिटेक्शन 12,13,14,15में भी व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं, लेकिन ऐसी तकनीकों के लिए भारी उपकरणों की आवश्यकता होती है। मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्प्शन/आयनीकरण (MALDI) इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर16 या मोटी और पतली सेक्शन विधि17 जैसे नए तरीकों का उपयोग ग्लोमेरुलर डिटेक्शन में भी किया गया है, हालांकि वे थकाऊ और श्रमसाध्य रहते हैं।
पारदर्शिता प्रौद्योगिकियों की मदद से, गहरी गहराई का निरीक्षण करना और मोटे ऊतकों या यहां तक कि पूरे अंगों 18,19,20,21,22,23से समृद्ध और अधिक संपूर्ण जानकारी प्राप्त करना संभव है। इसलिए, पारदर्शिता प्रौद्योगिकियों व्यापक रूप से गुर्देअनुसंधान 24 में इस्तेमाल किया गया है. साफ गुर्दे में ग्लोमेरुली का अवलोकन और पता लगाना भी शामिल है। हालांकि, इन प्रकाशित लेखों को या तो केवल संक्षेप में ग्लोमेरुलर डिटेक्शन25 के लिए संदर्भित किया गया था या ग्लोमेरुली को लेबल करने के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों26, स्व-उत्पादित रंजक13, या उच्च सांद्रता एंटीबॉडी इनक्यूबेशन27 जैसे मुश्किल-से-प्राप्त लेबलिंग विधियों का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, हालांकि अध्ययनों ने साफ गुर्दे में ग्लोमेरुली का विश्लेषण किया था, विश्लेषण हमेशा13 तक सीमित थे या लेखकों द्वारा स्वयं26 द्वारा स्थापित विश्लेषण एल्गोरिदम पर निर्भर थे।
हम पहले चूहों के गुर्दे28 में ग्लोमेरुली लेबल करने के लिए एक और अधिक सुविधाजनक तरीका का प्रदर्शन किया है. इमारिस का उपयोग करके, हमने पाया कि ग्लोमेरुली गिनती, आवृत्ति और मात्रा जल्दी से प्राप्त की जा सकती है। इस प्रकार, यहां हम चूहों के गुर्दे के ग्लोमेरुली को लेबल और विश्लेषण करने के तरीकों का एक अधिक सुलभ, व्यापक और सरलीकृत सेट प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक-समाशोधन प्रौद्योगिकियों को 3 या 4 समूहों 29,30,31 में वर्गीकृत किया जा सकता है। कार्बनिक विलायक आधारित ऊतक समाशोधन (जैसे, डिस्को और पेगासोस), जलीय आधारित ऊतक समाशोधन (ज?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (82204951) और सिचुआन साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्रोग्राम (2020JDRC0102) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
