Un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo
Summary
Questo studio presenta una serie di metodi facili da usare, completi e semplici per etichettare e analizzare i glomeruli da reni di topo eliminati da CUBIC. Dati come il numero e il volume del glomerulo possono essere ottenuti in modo semplice e affidabile utilizzando l’isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano, la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) o la comune microscopia confocale e software come Imaris.
Abstract
I glomeruli sono unità fondamentali del rene; Pertanto, lo studio dei glomeruli è fondamentale per comprendere la funzione e la patologia renale. L’imaging biologico fornisce informazioni intuitive; Pertanto, è di grande importanza etichettare e osservare i glomeruli. Tuttavia, i metodi di osservazione dei glomeruli attualmente in uso richiedono operazioni complicate e i risultati possono perdere i dettagli dell’etichetta o le informazioni tridimensionali (3D). La tecnologia di eliminazione dei tessuti CUBIC (Brainmental Imaging Cocktails and Computational Analysis) chiara e senza ostacoli è stata ampiamente utilizzata nella ricerca renale, consentendo un rilevamento più accurato e una profondità di rilevamento più profonda. Abbiamo scoperto che i glomeruli di topo possono essere marcati in modo rapido ed efficace mediante iniezione di vena caudale di destrano FITC-destrano a medio peso molecolare seguita dal metodo di compensazione CUBIC. Il rene di topo ripulito potrebbe essere scansionato con un microscopio a foglio luminoso (o un microscopio confocale una volta tagliato) per ottenere pile di immagini tridimensionali di tutti i glomeruli nell’intero rene. Elaborati con un software appropriato, i segnali dei glomeruli potrebbero essere facilmente digitalizzati e ulteriormente analizzati per misurare il numero, il volume e la frequenza dei glomeruli.
Introduction
Il numero e il volume dei glomeruli sono molto importanti per la diagnosi e il trattamento di varie malattie renali 1,2,3,4,5. Il golden standard della stima del numero di glomeruli è la combinazione dissettore fisico/frazionatore. Tuttavia, questo metodo richiede reagenti e attrezzature speciali, il che lo rende lento e costoso 6,7,8,9. La biopsia fornisce una grande quantità di informazioni, ma ovviamente questo metodo è adatto solo per stime approssimative10,11. Le tecnologie di imaging medico, tra cui la risonanza magnetica (MRI), la tomografia computerizzata (TC) e i raggi X, sono anche ampiamente utilizzate nella rilevazione glomerulare 12,13,14,15, ma tali tecnologie richiedono strumenti ingombranti. Nuovi metodi, come lo spettrometro di massa per imaging a desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)16 o il metodo della sezione spessa e sottile17, sono stati utilizzati anche nella rilevazione glomerulare, sebbene rimangano noiosi e laboriosi.
Con l’aiuto delle tecnologie di trasparenza, è possibile osservare profondità più profonde e ottenere informazioni più ricche e complete da tessuti spessi o addirittura da interi organi 18,19,20,21,22,23. Pertanto, le tecnologie di trasparenza sono state ampiamente utilizzate nella ricerca sui reni24. Sono coinvolti anche l’osservazione e il rilevamento dei glomeruli nei reni puliti. Tuttavia, questi articoli pubblicati si riferivano solo brevemente alla rilevazione glomerulare25 o utilizzavano metodi di marcatura difficili da raggiungere come gli animali transgenici26, i coloranti autoprodotti13 o l’incubazione di anticorpi ad alta concentrazione27 per etichettare i glomeruli. Inoltre, sebbene gli studi avessero analizzato i glomeruli nei reni chiariti, le analisi erano sempre limitate13 o si basavano su algoritmi di analisi stabiliti dagli autori stessi26.
In precedenza abbiamo dimostrato un modo più conveniente per etichettare i glomeruli nei reni dei topi28. Utilizzando Imaris, abbiamo scoperto che il numero, la frequenza e il volume dei glomeruli potevano essere ottenuti rapidamente. Pertanto, qui presentiamo un insieme più accessibile, completo e semplificato di metodi per etichettare e analizzare i glomeruli dei reni dei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecnologie di pulizia dei tessuti possono essere classificate in 3 o 4 gruppi: 29,30,31. La pulizia dei tessuti a base di solventi organici (ad es. DISCO e PEGASOS), la pulizia dei tessuti a base acquosa (ad es. CUBIC) e la pulizia dei tessuti con incorporazione di idrogel (ad es. CLARITY) sono state tutte applicate nella pulizia dei reni 25,26,28,32.<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82204951) e del Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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