마우스 사구체를 표지하고 분석하기 위한 효율적이고 빠른 방법
Summary
이 연구는 CUBIC이 제거된 마우스 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 사용하기 쉽고 완전하며 간단한 방법 세트를 제시합니다. 사구체 수 및 부피와 같은 데이터는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 광시트 형광 현미경(LSFM) 또는 일반적인 컨포칼 현미경 및 Imaris와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽고 안정적으로 얻을 수 있습니다.
Abstract
사구체는 신장의 기본 단위입니다. 따라서 사구체를 연구하는 것은 신장 기능과 병리를 이해하는 데 중추적인 역할을 합니다. 생물학적 이미징은 직관적인 정보를 제공합니다. 따라서 사구체에 라벨을 붙이고 관찰하는 것은 매우 중요합니다. 그러나 현재 사용되고 있는 사구체 관찰 방법은 복잡한 조작이 필요하며, 그 결과 라벨 디테일이나 3차원(3D) 정보가 손실될 수 있습니다. 명확하고 방해받지 않는 뇌 영상 칵테일 및 컴퓨터 분석(CUBIC) 조직 투명화 기술은 신장 연구에서 널리 사용되어 보다 정확한 검출과 더 깊은 검출 깊이를 제공합니다. 우리는 중분자량 FITC-Dextran의 꼬리 정맥 주입 후 CUBIC clearing 방법으로 마우스 사구체를 빠르고 효과적으로 표지할 수 있음을 발견했습니다. 제거된 쥐의 신장은 광시트 현미경(또는 얇게 썬 경우 컨포칼 현미경)으로 스캔하여 전체 신장에 있는 모든 사구체의 3차원 이미지 스택을 얻을 수 있습니다. 적절한 소프트웨어로 처리하면 사구체 신호를 쉽게 디지털화하고 추가로 분석하여 사구체의 수, 부피 및 주파수를 측정할 수 있습니다.
Introduction
사구체의 수와 양은 다양한 신장 질환의 진단과 치료에 매우 중요하다 1,2,3,4,5. 사구체 수 추정의 황금 표준은 물리적 해부기/분획기 조합입니다. 그러나 이 방법은 특수 시약과 장비가 필요하므로 느리고 비용이 많이 듭니다 6,7,8,9. 생검은 풍부한 정보를 제공하지만, 분명히, 이 방법은 대략적인 추정치에만 적합하다10,11. 자기공명영상(MRI), 컴퓨터단층촬영(CT) 및 X-ray를 포함한 의료 영상 기술도 사구체 검출에 널리 사용되지만(12,13,14,15) 이러한 기술에는 부피가 큰 기구가 필요하다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 이미징 질량 분석기(16) 또는 두껍고 얇은 단면 방법(17)과 같은 새로운 방법도 사구체 검출에 사용되어 왔지만, 여전히 지루하고 힘들다.
투명성 기술의 도움으로 더 깊은 깊이를 관찰하고 두꺼운 조직 또는 전체 장기로부터 더 풍부하고 완전한 정보를 얻을 수 있습니다 18,19,20,21,22,23. 따라서 투명성 기술은 신장 연구에서 널리 사용되어 왔다24. 깨끗해진 신장에서 사구체를 관찰하고 검출하는 것도 포함됩니다. 그러나, 이들 발표된 논문들은 사구체 검출(glomerular detection)25을 간략하게만 언급했거나, 사구체를 표지하기 위해 형질전환 동물(transgenic animals)26, 자체 생산된 염료(self-produced dye)13 또는 고농도 항체 배양(high-concentration antibody incubation)27과 같은 달성하기 어려운 표지 방법을 사용하였다. 또한, 여러 연구에서 투명신장의 사구체를 분석했지만, 분석은 항상 제한적이거나13 저자가 직접 수립한 분석 알고리즘에 의존했다26.
우리는 이전에 생쥐 신장에서 사구체를 표지하는 보다 편리한 방법을 시연한 바 있다28. Imaris를 사용하여 사구체 수, 빈도 및 부피를 빠르게 얻을 수 있음을 발견했습니다. 따라서, 여기서는 생쥐 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 보다 접근하기 쉽고 포괄적이며 단순화된 일련의 방법을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직 투명화 기술은 3개 또는 4개 그룹으로 분류할 수있다 29,30,31. 유기 용매 기반 조직 투명화(예: DISCO 및 PEGASOS), 수성 기반 조직 투명화(예: CUBIC) 및 하이드로겔 포매 조직 투명화(예: CLARITY)는 모두 신장 투명화에 적용되었습니다(25,26,28,32).<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립자연과학재단(82204951)과 쓰촨성 과학기술프로그램(2020JDRC0102)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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