Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos
Summary
Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.
Abstract
Os glomérulos são unidades fundamentais no rim; portanto, o estudo dos glomérulos é fundamental para a compreensão da função renal e da patologia. As imagens biológicas fornecem informações intuitivas; Assim, é de grande importância rotular e observar os glomérulos. No entanto, os métodos de observação de glomérulos atualmente em uso requerem operações complicadas, e os resultados podem perder detalhes do rótulo ou informações tridimensionais (3D). A tecnologia de limpeza de tecido de análise computacional (CUBIC) tem sido amplamente utilizada em pesquisas renais, permitindo uma detecção mais precisa e profundidade de detecção mais profunda. Descobrimos que os glomérulos de camundongos podem ser marcados rápida e efetivamente por injeção na veia caudal de FITC-Dextran de peso molecular médio seguida pelo método de limpeza cúbica. O rim de camundongo limpo poderia ser escaneado por um microscópio de folha de luz (ou um microscópio confocal quando fatiado) para obter pilhas de imagens tridimensionais de todos os glomérulos em todo o rim. Processados com software apropriado, os sinais dos glomérulos poderiam ser facilmente digitalizados e posteriormente analisados para medir o número, volume e frequência dos glomérulos.
Introduction
O número e o volume dos glomérulos são muito importantes para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças renais1,2,3,4,5. O padrão-ouro da estimativa do número de glomérulos é a combinação dissector físico/fracionador. Entretanto, esse método requer reagentes e equipamentos especiais, tornando-o lento e dispendioso 6,7,8,9. A biópsia fornece uma riqueza de informações, mas obviamente esse método só é adequado para estimativas aproximadas10,11. Tecnologias de imagem médica, incluindo ressonância magnética (RM), tomografia computadorizada (TC) e raios-X, também são amplamente utilizadas na detecção glomerular12,13,14,15, mas requerem instrumentos volumosos. Novos métodos, como o espectrômetro de massa de imagem por dessorção/ionização a laser assistido por matriz (MALDI)16 ou o método de cortes grossos e finos17, também têm sido usados na detecção glomerular, embora permaneçam tediosos e trabalhosos.
Com o auxílio das tecnologias de transparência, é possível observar profundidades mais profundas e obter informações mais ricas e completas de tecidos espessos ou mesmo de órgãos inteiros 18,19,20,21,22,23. Portanto, as tecnologias de transparência têm sido amplamente utilizadas na pesquisa renal24. A observação e detecção de glomérulos nos rins limpos também estão envolvidas. No entanto, esses artigos publicados ou se referiam apenas brevemente à detecção glomerular25 ou utilizavam métodos de marcação de difícil obtenção como animais transgênicos26, corantes autoproduzidos13 ou incubação de anticorpos em alta concentração27 para marcar os glomérulos. Além disso, apesar de estudos terem analisado glomérulos em rins liberados, as análises foram sempre limitadas13 ou baseadas em algoritmos de análise estabelecidos pelos próprios autores26.
Demonstramos anteriormente uma maneira mais conveniente de marcar os glomérulos em rins de camundongos28. Com o uso do Imaris, verificou-se que a contagem, a frequência e o volume dos glomérulos puderam ser obtidos rapidamente. Assim, apresentamos aqui um conjunto mais acessível, abrangente e simplificado de métodos para rotular e analisar os glomérulos de rins de camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
As tecnologias de desobstrução tecidual podem ser classificadas em 3 ou 4 grupos 29,30,31. A limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos (por exemplo, DISCO e PEGASOS), a limpeza de tecidos à base de água (por exemplo, CUBIC) e a limpeza de tecidos incorporados a hidrogel (por exemplo, CLARITY) foram aplicadas na limpeza renal 25,26,28,32.<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82204951) e do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
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