Эффективный и быстрый метод маркировки и анализа клубочков мышей
Summary
В этом исследовании представлен простой в использовании, полный и простой набор методов для маркировки и анализа клубочков из почек мышей, очищенных с помощью CUBIC. Такие данные, как количество и объем клубочков, могут быть легко и надежно получены с помощью флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана, флуоресцентной микроскопии со световым листом (LSFM) или обычной конфокальной микроскопии и программного обеспечения, такого как Imaris.
Abstract
Клубочки являются основными единицами в почках; Следовательно, изучение клубочков имеет решающее значение для понимания функции почек и патологии. Биологическая визуализация предоставляет интуитивно понятную информацию; Таким образом, большое значение имеет маркировка и наблюдение за клубочками. Однако используемые в настоящее время методы наблюдения клубочков требуют сложных операций, и результаты могут потерять детали меток или трехмерную (3D) информацию. Технология очистки тканей с четкой, беспрепятственной визуализацией мозга и вычислительным анализом (CUBIC) широко используется в почечных исследованиях, обеспечивая более точное обнаружение и большую глубину обнаружения. Мы обнаружили, что клубочки мышей могут быть быстро и эффективно помечены путем инъекции в хвостовую вену среднемолекулярного FITC-декстрана с последующим методом очистки CUBIC. Очищенная почка мыши может быть отсканирована с помощью светового микроскопа (или конфокального микроскопа при разрезе), чтобы получить трехмерные изображения всех клубочков во всей почке. Обработанные с помощью соответствующего программного обеспечения, сигналы клубочков могут быть легко оцифрованы и дополнительно проанализированы для измерения количества, объема и частоты клубочков.
Introduction
Количество и объем клубочков очень важны для диагностики и лечения различных заболеваний почек 1,2,3,4,5. Золотым стандартом оценки числа клубочков является комбинация физического диссектора и фракционатора. Однако этот метод требует специальных реагентов и оборудования, что делает его медленным и дорогим 6,7,8,9. Биопсия дает много информации, но очевидно, что этот метод подходит только для приблизительных оценок10,11. Технологии медицинской визуализации, в том числе магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ) и рентгенография, также широко используются при выявлении клубочков 12,13,14,15, но такие технологии требуют громоздких инструментов. Новые методы, такие как масс-спектрометр16 с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) или метод толстых и тонких срезов17, также используются для обнаружения клубочков, хотя они остаются утомительными и трудоемкими.
С помощью технологий прозрачности можно наблюдать более глубокие глубины и получать более богатую и полную информацию из толстых тканей или даже целых органов 18,19,20,21,22,23. Поэтому технологии прозрачности широко используются в исследованиях почек24. Также участвуют наблюдение и обнаружение клубочков в очищенных почках. Однако в этих опубликованных статьях либо лишь вскользь упоминалось о обнаружении клубочков25, либо использовались труднодостижимые методы маркировки, такие как трансгенные животные26, самостоятельно производимые красители13 или инкубация высококонцентрированных антител27 для маркировки клубочков. Кроме того, несмотря на то, что в исследованиях анализировались клубочки в очищенных почках, анализы всегда были ограничены13 или основывались на алгоритмах анализа, установленных самими авторами26.
Ранее мы продемонстрировали более удобный способ маркировки клубочков в почках мышей28. Используя Imaris, мы обнаружили, что количество, частота и объем клубочков могут быть быстро получены. Таким образом, здесь мы представляем более доступный, полный и упрощенный набор методов для маркировки и анализа клубочков почек мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тканевые очистительные технологии можно разделить на 3 или 4 группы 29,30,31. Очищение тканей на основе органических растворителей (например, DISCO и PEGASOS), очищение тканей на водной основе (например, CUBIC) и очистка тканей с внедрением гидрогеля…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82204951) и Сычуаньской научно-технической программы (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
