En effektiv och snabb metod för att märka och analysera musglomeruli
Summary
Denna studie presenterar en lättanvänd, komplett och enkel uppsättning metoder för att märka och analysera glomeruli från CUBIC-rensade musnjurar. Data som glomerulus antal och volym kan erhållas enkelt och tillförlitligt med hjälp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence mikroskopi (LSFM) eller vanlig konfokalmikroskopi och programvara som Imaris.
Abstract
Glomeruli är grundläggande enheter i njuren; Därför är studier av glomeruli avgörande för att förstå njurfunktion och patologi. Biologisk avbildning ger intuitiv information; Därför är det av stor betydelse att märka och observera glomeruli. De glomeruli-observationsmetoder som för närvarande används kräver dock komplicerade operationer, och resultaten kan förlora etikettdetaljer eller tredimensionell (3D) information. Den klara, obehindrade hjärnavbildningscocktails och beräkningsanalys (CUBIC) vävnadsrensningstekniken har använts i stor utsträckning inom njurforskning, vilket möjliggör mer exakt detektion och djupare detektionsdjup. Vi fann att musglomeruli snabbt och effektivt kan märkas genom svansveninjektion av medelmolekylär FITC-Dextran följt av CUBIC-clearingmetoden. Den rensade musnjuren kunde skannas med ett light-sheet-mikroskop (eller ett konfokalmikroskop när den skivades) för att få tredimensionella bildstaplar av alla glomeruli i hela njuren. Bearbetade med lämplig programvara kan glomerulisignalerna enkelt digitaliseras och analyseras ytterligare för att mäta antal, volym och frekvens av glomeruli.
Introduction
Antalet och volymen av glomeruli är mycket viktiga för diagnos och behandling av olika njursjukdomar 1,2,3,4,5. Den gyllene standarden för glomerulitalsuppskattning är den fysiska dissekeraren/fraktionatorkombinationen. Denna metod kräver dock speciella reagenser och utrustning, vilket gör den långsam och dyr 6,7,8,9. Biopsi ger en mängd information, men uppenbarligen är denna metod endast lämplig för grova uppskattningar10,11. Medicinsk bildteknik, inklusive magnetisk resonanstomografi (MRI), datortomografi (CT) och röntgen, används också i stor utsträckning vid glomerulär detektion 12,13,14,15, men sådan teknik kräver skrymmande instrument. Nya metoder, såsom matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) avbildande masspektrometer16 eller tjock- och tunnsnittsmetoden17, har också använts för glomerulär detektion, även om de fortfarande är tråkiga och mödosamma.
Med hjälp av transparensteknik är det möjligt att observera djupare djup och få rikare och mer fullständig information från tjocka vävnader eller till och med hela organ 18,19,20,21,22,23. Därför har transparensteknik använts i stor utsträckning inom njurforskning24. Observation och detektion av glomeruli i de rensade njurarna är också involverad. Dessa publicerade artiklar hänvisade dock antingen endast kortfattat till glomerulär detektion25 eller använde svåruppnådda märkningsmetoder såsom transgena djur26, egenproducerade färgämnen13 eller högkoncentrerad antikroppsinkubation27 för att märka glomeruli. Dessutom, även om studier hade analyserat glomeruli i rensade njurar, var analyserna alltid begränsade13 eller förlitade sig på analysalgoritmer som fastställts av författarna själva26.
Vi har tidigare visat ett bekvämare sätt att märka glomeruli i mössnjurar28. Genom att använda Imaris fann vi att glomeruliantal, frekvens och volym snabbt kunde erhållas. Således presenterar vi här en mer tillgänglig, omfattande och förenklad uppsättning metoder för att märka och analysera glomeruli hos mössnjurar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vävnadsrensningstekniker kan klassificeras i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk lösningsmedelsbaserad vävnadsclearing (t.ex. DISCO och PEGASOS), vattenbaserad vävnadsclearing (t.ex. CUBIC) och hydrogelinbäddningsvävnadsclearing (t.ex. CLARITY) har alla tillämpats vid njurrensning 25,26,28,32. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (82204951) och Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
