Denna studie presenterar en lättanvänd, komplett och enkel uppsättning metoder för att märka och analysera glomeruli från CUBIC-rensade musnjurar. Data som glomerulus antal och volym kan erhållas enkelt och tillförlitligt med hjälp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence mikroskopi (LSFM) eller vanlig konfokalmikroskopi och programvara som Imaris.
Glomeruli är grundläggande enheter i njuren; Därför är studier av glomeruli avgörande för att förstå njurfunktion och patologi. Biologisk avbildning ger intuitiv information; Därför är det av stor betydelse att märka och observera glomeruli. De glomeruli-observationsmetoder som för närvarande används kräver dock komplicerade operationer, och resultaten kan förlora etikettdetaljer eller tredimensionell (3D) information. Den klara, obehindrade hjärnavbildningscocktails och beräkningsanalys (CUBIC) vävnadsrensningstekniken har använts i stor utsträckning inom njurforskning, vilket möjliggör mer exakt detektion och djupare detektionsdjup. Vi fann att musglomeruli snabbt och effektivt kan märkas genom svansveninjektion av medelmolekylär FITC-Dextran följt av CUBIC-clearingmetoden. Den rensade musnjuren kunde skannas med ett light-sheet-mikroskop (eller ett konfokalmikroskop när den skivades) för att få tredimensionella bildstaplar av alla glomeruli i hela njuren. Bearbetade med lämplig programvara kan glomerulisignalerna enkelt digitaliseras och analyseras ytterligare för att mäta antal, volym och frekvens av glomeruli.
Antalet och volymen av glomeruli är mycket viktiga för diagnos och behandling av olika njursjukdomar 1,2,3,4,5. Den gyllene standarden för glomerulitalsuppskattning är den fysiska dissekeraren/fraktionatorkombinationen. Denna metod kräver dock speciella reagenser och utrustning, vilket gör den långsam och dyr 6,7,8,9. Biopsi ger en mängd information, men uppenbarligen är denna metod endast lämplig för grova uppskattningar10,11. Medicinsk bildteknik, inklusive magnetisk resonanstomografi (MRI), datortomografi (CT) och röntgen, används också i stor utsträckning vid glomerulär detektion 12,13,14,15, men sådan teknik kräver skrymmande instrument. Nya metoder, såsom matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) avbildande masspektrometer16 eller tjock- och tunnsnittsmetoden17, har också använts för glomerulär detektion, även om de fortfarande är tråkiga och mödosamma.
Med hjälp av transparensteknik är det möjligt att observera djupare djup och få rikare och mer fullständig information från tjocka vävnader eller till och med hela organ 18,19,20,21,22,23. Därför har transparensteknik använts i stor utsträckning inom njurforskning24. Observation och detektion av glomeruli i de rensade njurarna är också involverad. Dessa publicerade artiklar hänvisade dock antingen endast kortfattat till glomerulär detektion25 eller använde svåruppnådda märkningsmetoder såsom transgena djur26, egenproducerade färgämnen13 eller högkoncentrerad antikroppsinkubation27 för att märka glomeruli. Dessutom, även om studier hade analyserat glomeruli i rensade njurar, var analyserna alltid begränsade13 eller förlitade sig på analysalgoritmer som fastställts av författarna själva26.
Vi har tidigare visat ett bekvämare sätt att märka glomeruli i mössnjurar28. Genom att använda Imaris fann vi att glomeruliantal, frekvens och volym snabbt kunde erhållas. Således presenterar vi här en mer tillgänglig, omfattande och förenklad uppsättning metoder för att märka och analysera glomeruli hos mössnjurar.
Vävnadsrensningstekniker kan klassificeras i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk lösningsmedelsbaserad vävnadsclearing (t.ex. DISCO och PEGASOS), vattenbaserad vävnadsclearing (t.ex. CUBIC) och hydrogelinbäddningsvävnadsclearing (t.ex. CLARITY) har alla tillämpats vid njurrensning 25,26,28,32. …
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (82204951) och Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |