Kvalitativ og kvantitativ analyse av sideroforproduksjon fra Pseudomonas aeruginosa
Summary
Denne protokollen gir både kvalitative og kvantitative analyser av totale sideroforer, pyoverdin og pyochelin fra Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er kjent for sin produksjon av et mangfoldig utvalg av virulensfaktorer for å etablere infeksjoner i verten. En slik mekanisme er rensing av jern gjennom sideroforproduksjon. P. aeruginosa produserer to forskjellige sideroforer: pyochelin, som har lavere jernchelaterende affinitet, og pyoverdin, som har høyere jernchelaterende affinitet. Denne rapporten viser at pyoverdin kan kvantifiseres direkte fra bakterielle supernatanter, mens pyochelin må ekstraheres fra supernatanter før kvantifisering.
Den primære metoden for kvalitativt analyse av siderophoreproduksjon er Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarplateanalysen. I denne analysen fører frigjøringen av CAS-fargestoff fra Fe3+-Dye-komplekset til en fargeendring fra blå til oransje, noe som indikerer sideroforproduksjon. For kvantifisering av totale sideroforer ble bakterielle supernatanter blandet i like store mengder med CAS-fargestoff i en mikrotiterplate, etterfulgt av spektrofotometrisk analyse ved 630 nm. Pyoverdin ble direkte kvantifisert fra bakteriell supernatant ved å blande den i like store mengder med 50 mM Tris-HCl, etterfulgt av spektrofotometrisk analyse. En topp på 380 nm bekreftet tilstedeværelsen av pyoverdine. Når det gjelder Pyochelin, var direkte kvantifisering fra bakteriell supernatant ikke mulig, så det måtte ekstraheres først. Påfølgende spektrofotometrisk analyse viste tilstedeværelsen av pyochelin, med en topp på 313 nm.
Introduction
Organismer krever jern for å utføre ulike vitale funksjoner, for eksempel elektrontransport og DNA-replikasjon1. Pseudomonas aeruginosa, et gramnegativt opportunistisk patogen, er kjent for å ha en rekke virulensfaktorer for å etablere infeksjon i verten, blant annet en mekanisme er siderofordannelse2. Under jernnedbrytende forhold frigjør P. aeruginosa spesialiserte molekyler kalt siderophorer, som slukker jern fra omgivelsene. Siderophores chelate jern ekstracellulært, og det resulterende ferric-siderophore komplekset transporteres aktivt tilbake til cellen3.
P. aeruginosa er kjent for å produsere to sideroforer, pyoverdine og pyochelin. Pyoverdin er kjent for å ha en høyere jernchelaterende affinitet (1: 1), mens pyochelin er kjent for å ha en mindre jernchelaterende affinitet (2: 1) 4. Pyochelin kalles også en sekundær siderophore fordi den har en lavere jernchelaterende affinitet5. Produksjon og regulering av sideroforer styres aktivt av Quorum Sensing (QS) systemer i P. aeruginosa6.
I tillegg til jernslukking er sideroforer også involvert i regulering av virulensfaktorer og spiller en aktiv rolle i biofilmdannelse7. Siderophores tjener ytterligere viktige roller, inkludert involvering i cellesignalering, forsvar mot oksidativt stress og tilrettelegging av interaksjoner mellom mikrobielle samfunn8. Siderophores er vanligvis kategorisert basert på de spesifikke funksjonelle gruppene som de chelaterer jern gjennom. De tre primære bidentatligandene i denne klassifiseringen er catecholate, hydroxamate og α-hydroxycarboxylate3. Pyoverdiner er kjennetegn på fluorescerende Pseudomonas-arter som P. aeruginosa og P. fluorescens5. De består av en blandet grønn fluorescerende kromofor koblet til et oligopeptid inneholdende 6-12 aminosyrer. Flere ikke-ribosomale peptidsyntetaser (NRP) er involvert i deres syntese9. Fire gener involvert i pyoverdinproduksjon og regulering er pvdL, pvdI, pvdJ og pvdD10. Pyoverdine er også ansvarlig for infeksjon og virulens hos pattedyr11. P. aeruginosa er kjent for å produsere pyochelin under moderate jernbegrensende forhold, mens pyoverdin produseres under alvorlige jernbegrensende miljøer12. To operoner involvert i pyochelinproduksjon er pchDCBA og pchEFGHI13. Det bemerkes at i nærvær av pyocyanin induserer pyochelin (katkolat) oksidativ skade og betennelse og genererer hydroksylradikaler, som er skadelige for vertsvev11.
Chrome Azurol Sulfonate (CAS) analysen er allment vedtatt på grunn av sin omfattende, høye følsomhet og større bekvemmelighet sammenlignet med mikrobiologiske analyser, som, selv om de er følsomme, kan være altfor spesifikke14. CAS-analysen kan utføres på agaroverflater eller i en løsning. Den er avhengig av fargeendringen som oppstår når jernionet overgår fra sitt intense blå kompleks til oransje. CAS-kolorimetrisk analyse kvantifiserer uttømmingen av jern fra et Fe-CAS-surfaktant ternært kompleks. Dette spesielle komplekset, bestående av metall, organisk fargestoff og overflateaktivt middel, har en blå farge og utviser en absorpsjonstopp ved 630 nm.
Denne rapporten presenterer en metode for kvalitativ påvisning av sideroforproduksjon, hvor man kan oppdage produksjonen av sideroforer på en agarplate. En metode for kvantitativ estimering av total sideroforproduksjon i en mikrotiterplate og deteksjon og kvantitativ analyse av to sideroforer, pyoverdin og pyochelin, fra P. aeruginosa, er også gitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gjør det mulig for forskere å kvantifisere totale sideroforer og to forskjellige siderophorer av P. aeruginosa, nemlig pyoverdin og pyochelin, fra den bakterielle cellefrie supernatanten. I CAS-agarplateanalysen danner CAS-fargestoff og Fe3+-ioner et kompleks. Når bakterier produserer sideroforer, slukker de Fe3+-ioner fra CAS-Fe3+-komplekset, noe som fører til en fargeendring rundt bakterieveksten. Denne endringen resulterer i en klar oransje halo rundt bak…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere anerkjenner finansiering fra DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program og FIST. MR takk fellesskap mottatt fra SHODH. HP takk fellesskap mottatt fra CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biologie. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
