果蝇菌株的原始生殖细胞冷冻保存和复兴
Summary
果 蝇 菌株的长期保存方法作为成年苍蝇频繁转移到新鲜食品瓶的替代方案是非常可取的。该方案描述了 果蝇 原始生殖细胞的冷冻保存和菌株通过移植到非配子宿主胚胎的复兴。
Abstract
果蝇 菌株必须通过频繁地将成年果蝇转移到新的小瓶中来维持。这带来了突变恶化和表型变化的危险。因此，开发一种无需此类更改即可长期保存的替代方法势在必行。尽管以前有过成功的尝试，但由于可重复性低， 果蝇 胚胎的冷冻保存仍然没有实际用途。在这里，我们描述了一种通过将冷冻保存的PGC移植到非配子 果蝇黑腹 果蝇（D. melanogaster）宿主胚胎中来冷冻保存和菌株复兴的方案。PGC对冷冻保护剂（CPA）具有高度渗透性，菌株之间的发育和形态变异比胚胎冷冻保存中的问题要小。在这种方法中，从大约30个供体胚胎中收集PGC，在CPA处理后加载到针中，然后在液氮中冷冻保存。为了产生供体来源的配子，将针头中冷冻保存的PGC解冻，然后沉积到大约15个非配子宿主胚胎中。使用该协议实现了至少15%的可育果蝇的频率，并且每对可育夫妇的后代数量总是足以恢复原始菌株（平均后代数量为77.2±7.1），表明冷冻保存的PGC具有成为生殖干细胞的能力。每针平均可育果蝇数量为1.1±0.2只，26根针中有9只产生两个或两个以上的可育后代。结果发现，11根针足以产生6个或更多的后代，其中可能至少包括一名雌性和一名雄性。非配属宿主可以通过简单地将新出现的雌性和雄性苍蝇杂交来快速恢复菌株。此外，PGC具有用于基因工程应用的潜力，例如基因组编辑。
Introduction
通过将成蝇转移到新的食品瓶中来维持果蝇菌株不可避免地导致突变的积累和表观遗传变化。开发一种长期维持果蝇菌株而不进行这种变化的替代方法势在必行，特别是对于必须维持全基因组的参考菌株。已经描述了几种冷冻保存果蝇胚胎或卵巢的成功尝试 1,2,3。不幸的是，由于可重复性低，它们仍然没有实际用途。事实上，早期胚胎在冷冻保存后的存活率较低，因为它们的卵黄含量高，这阻碍了冷冻保护剂 （CPA） 的渗透和扩散 2,3。CPA通透性也受到晚期胚胎蜡质层的严重限制。要找到一个特定菌株的时间段，在这个时间段内，胚胎具有较高的存活率和较薄的蜡层，这是困难和耗时的。最近，Zhan等4改进了胚胎透化、CPA加载和玻璃化的方法，并成功冷冻保存了多个菌株的胚胎。然而，这些方法不容易应用，因为透化后胚胎的活力往往较差。因此，仍然需要进一步改进和发展替代方法。涉及原始生殖细胞 （PGC） 冷冻保存的方法是长期维持果蝇菌株的替代方法。
PGC（也称为极细胞）移植已被用于产生生殖系嵌合体，尤其是雌性，以研究诸如合子致死突变的母体效应和生殖细胞的性别决定等过程 5,6,7,8,9,10,11,12 .PGC比胚胎小得多，并且可能对大多数冷冻保护剂具有高度渗透性。此外，菌株之间的发育和形态变异问题较少，非配子宿主可以快速恢复全基因组。我们最近开发了一种PGC冷冻保存13的新方法，该方法可以防止果蝇菌株中不可避免的遗传和表观遗传变化。在这里，我们介绍详细的协议。
这种冷冻保存方法需要 PGC 处理和仪器方面的特定专业知识。虽然对于那些不熟悉它的人来说，循序渐进的方法可能是一种有效的解决方案，但由于仪器要求，它可能不适合小型实验室。与胚胎冷冻保存方案相比，这种PGC冷冻保存方案可以更容易地适用于不同的果蝇物种和不同的昆虫物种，因为发育和形态学差异较小。PGCs还可能用于基因工程应用，如基因组编辑14,15,16。总之，这种方法可用于库存中心和其他实验室，以长时间保持苍蝇和其他昆虫菌株而不发生变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
PGC冷冻保存和恢复成功的关键因素是使用好的胚胎。应使用年轻雌性（例如，3 至 5 日龄）进行胚胎采集。供体和宿主胚胎都通过显微镜检查进行评估，并且仅使用胚层阶段（第 5 阶段）的胚胎12.对于 PGC 收集，我们通常在 20 分钟内对齐大约 40 个供体胚胎，并在早期阶段从大约 30 个胚胎中收集 PGC;不使用较老和有缺陷的胚胎。冷冻保存和解冻后，PGC应保持其形状;PGCs在保存不成?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢京都果蝇库存中心的苍蝇菌株。我们还要感谢 Wanda Miyata 女士对手稿的英文编辑，以及 Edanz 的 Jeremy Allen 博士（https://jp.edanz.com/ac 年）编辑了这份手稿的草稿。这项工作得到了日本医学研究与开发机构 （AMED） 对 T.T.-S.-K. 的赠款（JP16km0210072、JP17km0210146、JP18km0210146）的支持，AMED 对 SK 的赠款（JP16km0210073、JP17km0210147、JP18km0210145）、AMED 对 T.T.-S.-K 的赠款（JP20km0210172）。S.K.，日本科学振兴会（JSPS）向T.T.-S.-K.提供的科学研究补助金（C）（JP19K06780），以及JSPS向S.K.提供的创新领域科学研究补助金（JP18H05552）。
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
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